本文關(guān)鍵詞：PCT單克隆抗體的制備及其ELISA檢測方法的初步建立

  更多相關(guān)文章： PCT 單克隆抗體 雙抗體夾心ELISA方法 細(xì)菌感染

【摘要】：目的:降鈣素原(PCT)是一種在感染的情況下由細(xì)菌、寄生蟲和真菌感染等感染誘導(dǎo)刺激產(chǎn)生釋放的一種蛋白質(zhì)。在健康狀態(tài)下,PCT的含量處于較低的水平(0.1 ng/mL),但是在細(xì)菌感染、膿毒癥、敗血癥等情況下PCT水平顯著升高(2 ng/mL)。目前PCT檢測在臨床中得到了廣泛應(yīng)用,相關(guān)檢測方法和產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)。但PCT檢測試劑的核心成分-PCT抗體國內(nèi)一直未解決,國內(nèi)PCT酶聯(lián)免疫檢測方法的研究尚處于起步階段。制備可用于臨床的單克隆抗體和建立PCT酶聯(lián)免疫檢測方法是目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在利用單克隆抗體制備技術(shù),制備符合臨床使用要求的PCT單克隆抗體,并用其建立PCT酶聯(lián)免疫定量檢測方法,為臨床判別細(xì)菌性感染疾病和抗生素合理應(yīng)用提供一種有效的方法和應(yīng)用指導(dǎo)。方法:用his-hrPCT抗原作為免疫原免疫BaLb/c小鼠,間接ELISA法檢測免疫效價(jià)。采用免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合制備雜交瘤細(xì)胞,利用trx-hrPCT蛋白作為包被抗體,HRP-抗鼠IgG作為酶標(biāo)抗體,通過間接ELISA法篩選陽性細(xì)胞株,并通過有限稀釋法篩選、獲得穩(wěn)定的單克隆抗體細(xì)胞株,從而制備單克隆抗體。采用雙抗體夾心法篩選獲得配對的PCT單抗,通過對其包被液及包被條件選擇、封閉液及封閉條件選擇、最佳包被抗體濃度和酶標(biāo)抗體濃度確定、最佳反應(yīng)時(shí)間、線性范圍、批內(nèi)精密性、回收率、穩(wěn)定性、靈敏度及特異性、干擾因素、臨床標(biāo)本檢測等研究,建立PCT酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法的檢測方法。結(jié)果:當(dāng)小鼠免疫效價(jià)達(dá)到1:105后,以脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行3次細(xì)胞融合,篩選得到10株陽性細(xì)胞株,通過有限稀釋法3次克隆化最終獲得4株陽性細(xì)胞株,分別命名為F1D5,F2H3,F3B7,F3D2。注射腹腔制備腹水,間接ELISA檢測效價(jià)均達(dá)到3.2×105,以辛酸-硫酸銨法純化抗體。標(biāo)記抗體,獲得一組(F1D5、F3B7)配對單抗,并以此為基礎(chǔ)研究確定PCT雙抗體夾心ELISA檢測的相關(guān)條件:包被液及包被條件為0.05 mol/L、pH 9.6的CB緩沖液4℃包被12 h;封閉液及封閉條件為0.6%BSA 37℃封閉2 h;最佳包被抗體F1D5濃度為400 ng/mL,酶標(biāo)抗體F3B7濃度為1:8000;37℃孵育30 min,酶標(biāo)二抗孵育30 min,顯色20 min的反應(yīng)模式。建立的檢測方法線性范圍為0.5 ng/mL-10ng/mL(R2=0.9912);批內(nèi)精密性小于10%;高中低值平均回收率分別為99.00%、98.68%、108.69%;穩(wěn)定性檢測顯示:37℃可穩(wěn)定保存9天;靈敏度為95.6%,特異性為97.8%;PCT陰性及陽性干擾物質(zhì)對本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯干擾;與羅氏檢測試劑盒對比檢測200份臨床血清,顯示相關(guān)性良好(R2=0.9391)。結(jié)論:獲得一組配對的PCT單克隆抗體,并初步建立了雙抗體夾心ELISA檢測PCT的定量檢測方法。
【關(guān)鍵詞】：PCT 單克隆抗體 雙抗體夾心ELISA方法 細(xì)菌感染
【學(xué)位授予單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-22
• 1.1 降鈣素原概述12-13
• 1.1.1 降鈣素原來源12
• 1.1.2 降鈣素原生物學(xué)功能12-13
• 1.2 降鈣素原檢測的臨床意義13-16
• 1.2.1 敗血癥的輔助診斷、療效監(jiān)測13-14
• 1.2.2 膿毒癥的輔助診斷、療效監(jiān)測14
• 1.2.3 細(xì)菌性和非細(xì)菌性炎癥鑒別14-15
• 1.2.4 其他相關(guān)疾病的輔助診斷、療效評估15-16
• 1.3 降鈣素原檢測方法16-18
• 1.3.1 免疫比濁法16
• 1.3.2 化學(xué)發(fā)光16-17
• 1.3.3 膠體金17
• 1.3.4 熒光層析17
• 1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)17-18
• 1.4 單克隆抗體制備技術(shù)發(fā)展18-20
• 1.4.1 鼠源性單抗制備技術(shù)發(fā)展18-19
• 1.4.2 嵌合抗體單抗制備技術(shù)發(fā)展19-20
• 1.4.3 噬菌體抗體庫單抗制備技術(shù)20
• 1.4.4 轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人抗體20
• 1.5 課題研究的意義及內(nèi)容20-22
• 1.5.1 課題研究意義20-21
• 1.5.2 課題研究的主要內(nèi)容21-22
• 第二章 材料和方法22-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-30
• 2.1.1 主要生物化學(xué)試劑22-24
• 2.1.2 主要緩沖液24-27
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備27-28
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 2.1.6 其他材料29-30
• 2.2 試驗(yàn)方法30-35
• 2.2.1 降鈣素原單克隆抗體的制備30-35
• 2.3 單克隆抗體標(biāo)記及配對35
• 2.3.1 抗體標(biāo)記35
• 2.3.2 抗體配對35
• 2.4 降鈣素原定量檢測方法的建立35-37
• 2.4.1 初步反應(yīng)模式的確定35-36
• 2.4.2 包被液及包被條件選擇36
• 2.4.3 封閉液及封閉條件的選擇36
• 2.4.4 包被抗體和酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定36
• 2.4.5 反應(yīng)模式的確定36-37
• 2.4.6 線性范圍初步研究37
• 2.4.7 批內(nèi)精密性實(shí)驗(yàn)37
• 2.4.8 回收率考察37
• 2.4.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)37
• 2.5 實(shí)驗(yàn)室臨床標(biāo)本檢測37-39
• 2.5.1 靈敏度及特異性檢測實(shí)驗(yàn)37-38
• 2.5.2 干擾因素檢測實(shí)驗(yàn)38
• 2.5.3 臨床標(biāo)本檢測實(shí)驗(yàn)38-39
• 第三章 結(jié)果和分析39-50
• 3.1 單抗制備39-42
• 3.1.1 抗原免疫結(jié)果39
• 3.1.2 間接ELISA檢測方法的建立39
• 3.1.3 細(xì)胞融合結(jié)果39-40
• 3.1.4 染色體鑒定結(jié)果40
• 3.1.5 單抗亞型測定結(jié)果40
• 3.1.6 細(xì)胞株穩(wěn)定性測定40-41
• 3.1.7 腹水制備結(jié)果效價(jià)測定41
• 3.1.8 腹水蛋白濃度及SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果41-42
• 3.2 降鈣素原單抗的配對實(shí)驗(yàn)結(jié)果42
• 3.3 降鈣素原定量檢測方法的建立42-47
• 3.3.1 包被液及包被條件選擇42-43
• 3.3.2 封閉液及封閉條件選擇43-44
• 3.3.3 最佳抗體包被濃度和酶標(biāo)濃度的確定44-45
• 3.3.4 反應(yīng)時(shí)間的確定45
• 3.3.5 線性范圍的初步確定45
• 3.3.6 批內(nèi)精密性45-46
• 3.3.7 回收率46
• 3.3.8 穩(wěn)定性46-47
• 3.4 實(shí)驗(yàn)室臨床標(biāo)本檢測47-50
• 3.4.1 靈敏度及特異性47
• 3.4.2 干擾因素檢測47-49
• 3.4.3 臨床實(shí)驗(yàn)49-50
• 第四章 討論50-52
• 4.1 單抗制備方法的選擇50
• 4.2 試劑盒研究50-52
• 第五章 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 致謝58-59

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本文編號(hào)：724156