本文關(guān)鍵詞：靶向Group2流感病毒血凝素莖部的廣譜反應(yīng)性抗體篩選與研究

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【摘要】：流感病毒是抗原性高度變異的病毒,尤其是甲型流感病毒,具有更廣泛的宿主及高度變異性,根據(jù)病毒血凝素(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA),甲型流感病毒分為18個(gè)HA亞型(H1-H18)和11個(gè)NA亞型(N1-N11),18個(gè)HA亞型包括兩個(gè)組(Group),即Group1 (H1、H2、 H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18)和Group2 (H3、H4、 H7、H10、H14和H15)。HA是病毒表面主要抗原,由高度變異的頭部和相對(duì)保守的莖部[Cys52-Cys277 (H3序號(hào))]組成。目前預(yù)防流感病毒的主要措施是疫苗接種,疫苗組份包括甲型流感病毒(H1N1和H3N2亞型)和一個(gè)或兩個(gè)乙型流感病毒株,疫苗主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)HA頭部的抗體應(yīng)答,但HA頭部易發(fā)生變異導(dǎo)致病毒抗原漂移,造成疫苗株與流行株抗原不匹配。而疫苗接種不易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生靶向HA莖部的抗體。近年來,通過雜交瘤、噬菌體展示、B細(xì)胞克隆技術(shù)陸續(xù)從人和小鼠分離到對(duì)多個(gè)流感病毒亞型有廣譜中和活性的單克隆抗體,大多數(shù)抗體(如6F12、CR6261、F10、C179、KB2、GG3、2D1等)靶向Group 1 HA,而靶向Group2HA的廣譜中和抗體(CR8020、CR8043、VIS410)及靶向Group1/2HA的單抗(FI6、CR9114、CT149)為數(shù)不多,該類抗體有效結(jié)合濃度在1-40μg/ml,其中部分抗體不能有效中和H7或H10亞型毒株�？贵w除通過Fab結(jié)合病毒抗原發(fā)揮中和活性,在體內(nèi)抗體也可通過Fc介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒效應(yīng)(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒效應(yīng)(complement dependent cytotoxicity, CDC)來殺傷病毒感染的靶細(xì)胞。如CR9114抗體在體外不能中和乙型流感病毒,但在體內(nèi)能通過ADCC保護(hù)小鼠免受病毒攻擊。本課題旨在對(duì)季節(jié)性流感疫苗人群篩選靶向Group2流感病毒血凝素莖部的廣譜反應(yīng)性抗體。實(shí)驗(yàn)流程為：1.制備桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)嵌合cH7/3HA(由A/Netherlands/219/03(H7N7)亞型流感HA頭部和A/Aichi/2/1968(H3N2)亞型HA莖部組成)和ZJH7 (A/Zhejiang/1/2013(H7N9))抗原。2.用cH7/3HA對(duì)49名在2009年接種季節(jié)性流感疫苗(A/Brisbane/59/2007(Bris59), A/Brisbane/I 0/2007和B/Brisbane/60/2008)免前0天、免后21天配對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè),與cH7/3結(jié)合陽性血清再經(jīng)ZJH7結(jié)合ELISA驗(yàn)證；測(cè)定陽性血清中ZJH7結(jié)合抗體的親和指數(shù)(AI)；用生物素標(biāo)記的FI6-370(識(shí)別Group 1/2 HA莖部)、F10(識(shí)別Group 1 HA莖部)抗體進(jìn)行競爭ELISA檢測(cè)；以血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)明確陽性血清識(shí)別的抗原區(qū)域。3.體外培養(yǎng)免后21天外周血記憶性B細(xì)胞(CD19+CD27+),取第10天培養(yǎng)細(xì)胞上清,用ZJH7抗原檢測(cè),并對(duì)陽性孔進(jìn)行IgG定量,重鏈、輕鏈分型,通過RT-PCR方法建立重鏈、輕鏈基因文庫,組合轉(zhuǎn)染篩選候選抗體基因,檢測(cè)篩選出的陽性抗體與Group2 HA(H3、7、10)抗原和Group1 HA(H1、5、9)抗原的結(jié)合活性；并檢測(cè)陽性單克隆抗體HI及ADCC效應(yīng)。結(jié)果如下：1.重組蛋白cH7/3、ZJH7HAs可在昆蟲細(xì)胞中分泌表達(dá),片段大小約為70kD,純化的cH7/3、ZJH7HAs蛋白以三聚體形式存在,有血凝活性和抗原反應(yīng)性。2.49名季節(jié)性疫苗接種者中,有六對(duì)(編號(hào)分別為048、049、057、095、139和152)血清在免后21天對(duì)cH7/3結(jié)合明顯增加；再以ZJH7抗原檢測(cè)這六對(duì)血清,只有152血清抗體免后21天與ZJH7結(jié)合的抗體滴度比免前高2.1倍以上,具有高親和指數(shù)(AI0.5),識(shí)別FI6-370及F10相似的HA表位、無HI活性。3.39孔152樣本的外周血記憶性B細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)ZJH7抗原結(jié)合,最后選擇B細(xì)胞狀態(tài)好,重鏈、輕鏈分型檢測(cè)OD值0.3以上共9孔進(jìn)行抗體基因克隆,建立mVH, mVL抗體庫。篩選出單克隆抗體H3-2/κ3-1能結(jié)合Group1 HA(H1、5、9)和Group2 HA(H3、7、10)抗原,最低有效結(jié)合濃度在30-7.0μg/ml;該抗體重鏈可變區(qū)為VH1-69*01編碼,HCDR3含19個(gè)氨基酸,與胚系基因相比VH有12個(gè)突變氨基酸位點(diǎn)；輕鏈由VK3-20*O1編碼,LCDR3含9個(gè)氨基酸,與胚系基因高度同源。H3-2/κ3-1抗體對(duì)Group 1病毒[Bris59HlNl和RGH5N6(含A/Guangdong/1/2014(H5N6) HA NA抗原)]和Group2病毒[RG ZJH7N9和RGH10N8含A/Jiangxi/346/2013(H10N8) HA^ NA抗原)均無HI反應(yīng)活性。H3-2/κ3-1抗體具有ADCC活性。結(jié)論：在季節(jié)性流感疫苗接種個(gè)體能檢測(cè)到靶向HA莖部的廣譜反應(yīng)性抗體,檢出率為2%(1/49),成功獲得了一株能廣泛結(jié)合Group 1/2 HA的單克隆抗體,最低結(jié)合濃度為3.0-7.0μg/ml,具有ADCC效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：流感病毒 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) Group2血凝素莖部抗體 B細(xì)胞 ADCC
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 縮略詞表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-17
• 第一節(jié) 流感病毒血凝素在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)和生物活性鑒定17-38
• 1 材料與方法17-33
• 1.1 試劑與耗材17-21
• 1.2 方法步驟21-33
• (一) cH7/3、ZJH7基因構(gòu)建21-24
• (二) Bacmid-cH7/3HA、Bacmid-ZJH7構(gòu)建24-27
• (三) Bacmid-cH7/3、Bacmid-ZJH7轉(zhuǎn)染昆蟲sf9細(xì)胞27-28
• (四) Bacmid-cH7/3、Bacmid-ZJH7重組蛋白的表達(dá)與純化28-29
• (五) cH7/3蛋白和ZJH7蛋白活性的鑒定29-33
• 2 結(jié)果及結(jié)論33-36
• 3 討論36-38
• 第二節(jié) 季節(jié)性流感疫苗免疫人群血清中Group2 HA莖部廣譜反應(yīng)性抗體水平的檢測(cè)38-53
• 1 材料和方法39-46
• 1.1 材料39-40
• 1.2 方法40-46
• (一) 間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)篩選Group2 HA莖部廣譜反應(yīng)性抗體40-41
• (二) 血清抗體親和指數(shù)(AI)的測(cè)定41-42
• (三) 檢測(cè)六對(duì)血清是否含有與FI6-370和F10抗體相似的抗原結(jié)合表位42-46
• 2 結(jié)果及結(jié)論46-51
• 3 討論51-53
• 第三節(jié) B細(xì)胞培養(yǎng)、抗體重鏈、輕鏈基因克隆及篩選Group2 HA莖部廣譜反應(yīng)性抗體53-79
• 1 材料和方法53
• 1.1 材料53-54
• 1.2 方法54-69
• (一) 記憶性B細(xì)胞培養(yǎng)54-55
• (二) B細(xì)胞培養(yǎng)上清中的陽性抗體篩選55-56
• (三) 抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增,篩選和分析56-64
• (四) 抗體大量表達(dá),純化及鑒定64-69
• 2 結(jié)果及結(jié)論69-77
• 3 討論77-79
• 結(jié)論與展望79-80
• 參考文獻(xiàn)80-88
• 綜述88-106
• 參考文獻(xiàn)99-106
• 致謝106-108
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文108-109
• 附錄 已發(fā)表論文全文109-115

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張?zhí)?王炳軍;田國華;田國寧;張金玲;侯志高;韓亮;張麗萍;;流感病毒血凝素受體分子的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年02期

2 王懋梁;流感病毒血凝素的結(jié)構(gòu)與功能[J];微生物學(xué)通報(bào);1986年06期

3 李敏紅;周敏;茅海燕;張嚴(yán)峻;盧亦愚;陳寅;;浙江省甲型H1N1流感病毒血凝素基因序列分析[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2013年06期

4 ;感染人H7N9流感病毒血凝素的晶體結(jié)構(gòu)及其與受體結(jié)合特性[J];中國基礎(chǔ)科學(xué);2013年04期

5 龔甜;熊英;劉麗萍;王飛霞;施勇;周s，

本文編號(hào)：715970