本文關(guān)鍵詞：通過定點突變表征綠膿桿菌芳香硫酸酯酶

  更多相關(guān)文章： 綠膿桿菌芳香硫酸酯酶 定點突變 熱激活 反應(yīng)中失活

【摘要】：背景:作為單通道光度法雙酶同測(SDESA-ELISA)的候選標(biāo)記酶-綠膿桿菌芳香基硫酸酯酶(PAAS)結(jié)構(gòu)已知,但存在比活較低與37℃熱穩(wěn)定性較差這些問題,難以滿足應(yīng)用的需要。因此,需要對此酶進(jìn)行分子工程改造,目前,定點突變因其高效性更多應(yīng)用于實際操作中。目的:定點突變輔助分析構(gòu)效關(guān)系,獲得高活性高穩(wěn)定性的芳香硫酸酯酶,作為SDESA-ELISA合適的標(biāo)記酶。方法:在活性中心周圍,針對催化區(qū)域進(jìn)行定點突變,經(jīng)測序確認(rèn)后,目的片段與含6-His標(biāo)簽的PET-24a載體結(jié)合,構(gòu)成重組質(zhì)粒;經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá),菌體裂解,蛋白純化后;表征各突變體;根據(jù)出現(xiàn)的特殊現(xiàn)象進(jìn)一步分析,再依據(jù)結(jié)果進(jìn)行新一輪設(shè)計得到相應(yīng)的突變體并表征�；拘再|(zhì)表征:包括SDS-PAGE,PAGE比活,酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù),最適pH,金屬離子影響等相關(guān)酶學(xué)性質(zhì);反應(yīng)中失活現(xiàn)象探究:各突變體反應(yīng)動力學(xué)曲線對比,產(chǎn)物的抑制作用及反應(yīng)期此酶穩(wěn)定性,針對M72K進(jìn)行磁珠吸附分離釋放再反應(yīng);MALDI-TOF及超高分辨質(zhì)譜直接檢測酶分子在反應(yīng)期是否發(fā)生修飾作用;對PAAS和各定點突變體的熱穩(wěn)定性進(jìn)行監(jiān)測:考察其處于37℃和4℃的半衰期;針對特殊現(xiàn)象,以同條件下野生型進(jìn)行同期對比,并進(jìn)行紫外吸收,熒光發(fā)射,同步熒光光譜掃描;以MALDI-TOF判斷是否發(fā)生修飾作用。針對PAAS換用不同類型的緩沖液儲存,考察37℃熱穩(wěn)定性差異。結(jié)果:活性中心位置附近定點突變對此酶的各項性質(zhì)影響很大。與野生型PAAS相比,最適pH,金屬離子影響等方面均出現(xiàn)顯著改變;其中R55K(幾乎失活),K375(針對底物專一性發(fā)生改變),M72系列(動力學(xué)參數(shù)下降約2個數(shù)量級)的改變最為突出;PAAS及其大多數(shù)突變體作用于其天然底物對硝基苯硫酸鉀(PNS)時,均出現(xiàn)隨反應(yīng)時間延長,動力學(xué)曲線發(fā)生明顯彎曲的現(xiàn)象(反應(yīng)中失活現(xiàn)象),尤其是M72系列突變體;經(jīng)MALDI-TOF及超高分辨質(zhì)譜結(jié)果顯示在反應(yīng)過程中可能此酶發(fā)生了硫酸化修飾作用。觀察到突變體M72K 37℃pH7.4儲存于不同緩沖液中均存在顯著的熱激活現(xiàn)象,(即在一定時間內(nèi)37℃p H7.4緩沖液中,M72K隨儲存時間延長,對PNS比活明顯增加,超過兩個數(shù)量級;)同步追蹤其吸收光譜與熒光光譜并與野生型PAAS在相同條件下進(jìn)行比較,出現(xiàn)了明顯改變;而PAAS 37℃儲存于不同緩沖液中,熱穩(wěn)定性差異較大,處于10mM pH7.4硼酸硼砂時,半衰期得到明顯延長。結(jié)論:通過定點突變后,PAAS各定點突變體酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生巨大改變,甚至出現(xiàn)特殊現(xiàn)象;這為初步探究構(gòu)效關(guān)系提供一定依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：綠膿桿菌芳香硫酸酯酶 定點突變 熱激活 反應(yīng)中失活
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-12
• 第一部分 PAAS各定點突變體的基本性質(zhì)表征12-27
• 1. 器材與材料12-17
• 2．實驗方法17-21
• 3. 結(jié)果21-26
• 4. 本部分小結(jié)26-27
• 第二部分 PAAS各定點突變體反應(yīng)中失活現(xiàn)象探索27-35
• 1. 器材與材料27
• 2. 實驗方法27-30
• 3. 結(jié)果30-34
• 4. 本部分小結(jié)34-35
• 第三部分 PAAS野生型及突變體的熱穩(wěn)定性35-57
• 1．器材與材料35-36
• 2. 實驗方法36-38
• 3. 結(jié)果38-56
• 4. 本部分小結(jié)56-57
• 全文總結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-60
• 文獻(xiàn)綜述60-65
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 致謝65-66
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Cihan DARCAN;Mustafa KAHYAOGLU;;The effect of Some Boron Derivatives on Kanamycin Resistance and Survival of E.coli and P.aeruginosa in Lake Water[J];Biomedical and Environmental Sciences;2012年04期

2 徐卉芳,張先恩,張治平,張用梅,A.E.G.CASS;大腸桿菌堿性磷酸酶的體外定向進(jìn)化研究[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2003年01期

，

本文編號：687966