本文關鍵詞：胞紅蛋白在氧化低密度脂蛋白誘導內皮細胞損傷中的作用及機制

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【摘要】：[目的]胞紅蛋白(cytoglobin,CYGB)是一種具有抗氧化應激作用的珠蛋白,研究顯示CYGB能夠通過抗氧化應激來達到細胞保護作用。本文旨在探討人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)在氧化損傷過程中CYGB的表達;構建CYGB表達/干擾質粒HUVECs模型,研究CYGB在氧化應激過程中對HUVECs的保護作用并探討可能的機制。[方法]1、培養(yǎng)HUVECs,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。2、實驗分為4組:對照組,25μg/ml oxLDL、50μg/ml oxLDL、100μg/ml oxLDL、200μg/ml oxLDL處理組;Western blot檢測HUVECs在不同濃度oxLDL刺激24h后,細胞內CYGB蛋白的表達水平;Western blot檢測HUVECs在100μg/ml oxLDL刺激不同時間(4、8、12、24h)后,細胞內CYGB蛋白的表達水平。3、將HUVECs分為4組:對照組、100μg/ml oxLDL組、100μg/ml oxLDL+CYGB組及100μg/ml oxLDL+CYGB sh RNA組,然后觀察在氧化應激時CYGB對HUVECs的作用。于24h后,檢測CYGB蛋白水平、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、乳酸脫氫酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)的活性以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,以及Bcl2和Bax的蛋白水平;4、將HUVECs分為3組:對照組、100μg/ml oxLDL組、100μg/ml oxLDL+Staurosporine(PKC抑制劑)組。觀察PKC抑制劑在oxLDL誘導HUVECs損傷中的作用。檢測CYGB蛋白水平、GSH-PX、SOD、LDH、MDA、Bcl2和Bax的蛋白水平。[結果]1、倒置顯微鏡下顯示,正常HUVECs呈現典型鋪路石狀態(tài)。2、Western blot結果顯示:0,25μg/ml oxLDL、50μg/ml oxLDL、100μg/ml oxLDL處理HUVECs 24h后,CYGB表達水平高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);100μg/ml oxLDL處理HUVECs 4、8、12、24h后,CYGB表達水平高于對照組,在24h組CYGB表達水平最高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、轉染CYGB表達質粒后HUVECs中CYGB的表達明顯增加;轉染CYGB干擾質粒后HUVECs中CYGB的表達明顯降低。4、Western blot結果顯示:100μg/ml oxLDL組和100μg/ml oxLDL+CYGB組中CYGB蛋白表達水平均高于正常對照組,而100μg/ml oxLDL+CYGB shRNA組中CYGB蛋白表達水平則低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與100μg/ml oxLDL組相比,100μg/ml oxLDL+CYGB組中細胞SOD、GSH-PX活性顯著提高,Bcl2的表達也顯著增加(P0.05),LDH的活性和MDA的含量明顯降低,Bax的表達明顯降低(P0.05);與100μg/ml oxLDL組相比,100μg/ml oxLDL+CYGB sh RNA組中細胞SOD、GSH-PX活性顯著降低,Bcl2的表達降低(P0.05),LDH的活性和MDA的含量明顯升高,Bax的表達增加(P0.05)。5、Western blot結果顯示:與正常對照組相比,100μg/ml oxLDL組CYGB表達升高;而與100μg/ml oxLDL組相比,100μg/ml oxLDL+Staurosporine組中CYGB蛋白表達水平降低(P0.05);與100μg/ml oxLDL組相比,100μg/ml oxLDL+Staurosporine組中細胞SOD、GSH-PX明顯降低,Bcl2的表達也顯著降低(P0.05),LDH的活性和MDA的含量明顯升高,Bax的表達明顯增加(P0.05)。[結論]1、CYGB在oxLDL引起的內皮細胞損傷中能發(fā)揮拮抗作用;2、CYGB發(fā)揮拮抗作用可能與PKC信號通路有關。
【關鍵詞】：人臍靜脈內皮細胞 氧化應激 胞紅蛋白 蛋白激酶C
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 第1章 緒論15-19
• 1.1 引言15-17
• 1.2 技術路線17-19
• 1.2.1 HUVECs形態(tài)觀察17
• 1.2.2 構建HUVECs的氧化損傷模型17
• 1.2.3 CYGB對oxLDL處理的HUVECs的保護作用17-18
• 1.2.4 CYGB對oxLDL處理的HUVECs保護作用的初步機制18-19
• 第2章 實驗材料19-21
• 2.1 細胞株19
• 2.2 主要試劑19-20
• 2.3 主要儀器20
• 2.4 數據分析20-21
• 第3章 實驗方法21-31
• 3.1 細胞培養(yǎng)21-22
• 3.1.1 細胞復蘇21
• 3.1.2 細胞傳代21
• 3.1.3 細胞凍存21-22
• 3.2 實驗分組22-23
• 3.3 oxLDL處理HUVECs對CYGB表達的影響23-26
• 3.3.1 不同濃度的oxLDL處理HUVECs對CYGB表達的影響23-25
• 3.3.1.1 試劑配制23-24
• 3.3.1.2 蛋白提取24
• 3.3.1.3 蛋白定量24
• 3.3.1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）24-25
• 3.3.2 oxLDL處理HUVECs不同時間對CYGB表達的影響25-26
• 3.4 CYGB表達/干擾HUVECs模型的構建和鑒定26
• 3.5 GSH-PX活性測定26-28
• 3.5.1 試劑組成及配制26-27
• 3.5.2 樣本處理27
• 3.5.3 GSH-PX活性測定操作步驟27-28
• 3.6 SOD活性檢測28-29
• 3.6.1 試劑組成及配制28
• 3.6.2 樣本處理28
• 3.6.3 SOD活性檢測步驟28-29
• 3.7 LDH活性檢測29-30
• 3.7.1 試劑組成及配制29
• 3.7.2 樣本處理29
• 3.7.3 LDH活性檢測步驟29-30
• 3.8 MDA含量檢測30-31
• 3.8.1 試劑組成及配制30
• 3.8.2 樣品處理30
• 3.8.3 MDA含量檢測步驟30-31
• 第4章 實驗結果31-47
• 4.1 細胞形態(tài)學觀察結果31
• 4.2 oxLDL處理HUVECs對CYGB表達的影響31-33
• 4.2.1 不同濃度oxLDL處理HUVECs對CYGB表達的影響31-32
• 4.2.2 oxLDL處理HUVECs不同時間對CYGB表達的影響32-33
• 4.3 CYGB對oxLDL處理的HUVECs的拮抗作用33-40
• 4.3.1 CYGB表達/干擾HUVECs的構建和鑒定33-34
• 4.3.2 oxLDL處理HUVECs對CYGB蛋白表達的影響34-35
• 4.3.3 CYGB對oxLDL處理HUVECs時GSH-PX、SOD、LDH活性及MDA含量的影響35-38
• 4.3.4 CYGB對oxLDL處理HUVECs時Bcl2、Bax蛋白表達的影響38-40
• 4.4 PKC抑制劑對HUVECs CYGB蛋白表達的影響40-41
• 4.4.1 PKC抑制劑的抑制效果40
• 4.4.2 PKC抑制劑對oxLDL處理的HUVECs中CYGB蛋白表達的影響40-41
• 4.5 CYGB對oxLDL處理的HUVECs的拮抗作用的初步機制41-47
• 4.5.1 PKC抑制劑對oxLDL處理的HUVECs中SOD、GSH-PX、LDH活性及MDA含量的影響41-44
• 4.5.2 PKC抑制劑對oxLDL處理的HUVECs中Bcl2、Bax蛋白表達的影響44-47
• 第5章 討論47-51
• 第6章 結論51-53
• 參考文獻53-57
• 綜述 新型缺氧保護因子胞紅蛋白的研究進展57-69
• 參考文獻64-69
• 攻讀學位期間的科研成果69-70
• 課題資助情況70-71
• 致謝71-72

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