本文關(guān)鍵詞：淋病奈瑟菌外膜蛋白反向候選疫苗的初步實(shí)驗(yàn)篩選

  更多相關(guān)文章： 淋病奈瑟菌 外膜蛋白 原核表達(dá) 包涵體純化 免疫原性 免疫反應(yīng)性 膜定位

【摘要】：目的從淋病奈瑟菌全基因組中已預(yù)測(cè)出的疫苗候選外膜蛋白中,選取兩種外膜蛋白和一種非外膜蛋白,克隆并表達(dá)出重組蛋白,用重組蛋白來免疫小鼠,獲取重組蛋白抗血清。對(duì)預(yù)測(cè)的外膜蛋白抗原進(jìn)行細(xì)菌表面定位以及免疫原性和免疫反應(yīng)性的初步實(shí)驗(yàn)研究,以探討反向疫苗學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法篩選淋病奈瑟菌候選外膜蛋白疫苗的可行性,為淋病奈瑟菌疫苗的研究提供了新的思路。方法1候選外膜蛋白抗原基因的克隆和表達(dá):前期研究已從淋病奈瑟菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)和分析出了一系列外膜蛋白,從中隨機(jī)選取兩種外膜蛋白(YP_207398.1和YP_207701.1)和一種非外膜蛋白(YP_207727.1)基因,用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成最佳引物,用PCR方法從淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 49226)基因組中擴(kuò)增出三個(gè)目的基因片段,以p GEX4T-1為載體分別構(gòu)建三種基因的重組質(zhì)粒,并在BL21宿主菌中分別誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)條件,用SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的表達(dá)情況。2重組蛋白的純化:細(xì)菌經(jīng)超聲破碎后,獲取菌體沉淀,分別用Triton X-100和尿素來洗滌包涵體,再對(duì)包涵體進(jìn)行溶解、復(fù)性和純化以獲取目的蛋白,同時(shí)采用切膠純化的方法來獲取目的蛋白。3重組外膜蛋白免疫反應(yīng)性和免疫原性及其在細(xì)菌膜表面定位的初步研究:(1)用乙醇滅活法制備的淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 49226)全細(xì)胞抗原并免疫家兔,獲取免疫血清,以免疫血清為一抗,用Western Blot技術(shù)檢測(cè)重組蛋白的免疫反應(yīng)性。(2)重組蛋白抗血清的制備:將每種重組蛋白以50μg的劑量與弗氏佐劑混合后免疫接種BALB/c小鼠,共免疫2次,每次間隔2周。末次免疫后1周,收獲免疫血清。(3)外膜蛋白抗原在細(xì)菌表面的定位:用淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 49226)制備的全細(xì)胞抗原包被96孔板,以小鼠免疫血清作為一抗,酶標(biāo)記的羊抗鼠Ig G作為二抗,檢測(cè)血清抗體滴度,以評(píng)價(jià)重組蛋白的免疫原性及其抗體與菌體表面蛋白的結(jié)合能力,從而初步判定預(yù)測(cè)的候選外膜蛋白的免疫原性及其是否位于淋病奈瑟菌表面。結(jié)果1構(gòu)建了淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株三個(gè)候選外膜蛋白基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒PGEX4T-1-YP_207398.1;PGEX4T-1-YP_207701.1;PGEX4T-1-YP_207727.1;SDS-PAGE顯示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,三個(gè)重組蛋白菌均以包涵體形式表達(dá),最佳表達(dá)條件分別是:YP_207398.1蛋白:37℃,2.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h;YP_207701.1蛋白:37℃,2.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)1h;YP_207727.1蛋白:37℃,0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h。2 Western Blot分析顯示:候選外膜蛋白抗原能夠被抗淋病奈瑟菌多克隆抗體識(shí)別。3成功獲得純化蛋白,用Triton X-100和尿素來洗滌包涵體后,再用包涵體溶解液溶解已洗滌的包涵體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個(gè)重組蛋白均不能充分溶解。而采用切膠、電洗脫和透析的方法可獲得重組蛋白的粗提物。4成功獲得三個(gè)重組蛋白的抗血清,通過間接ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn):淋病奈瑟菌全細(xì)胞抗原免疫組、YP_207701.1蛋白免疫組和YP_207398.1蛋白免疫組產(chǎn)生的免疫血清抗體均能夠和淋病奈瑟菌全細(xì)胞抗原發(fā)生特異性結(jié)合,其中YP_207701.1蛋白免疫組的血清效價(jià)高于YP_207398.1蛋白免疫組;而YP_207727.1蛋白免疫組的免疫血清抗體未能與淋病奈瑟菌全細(xì)胞抗原發(fā)生明顯結(jié)合。結(jié)論1成功構(gòu)建了PGEX4T-1-YP_207398.1;PGEX4T-1-YP_207701.1、PGEX4T-1-YP_207727.1三個(gè)原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌BL21內(nèi)得到了表達(dá),為本研究及后續(xù)的淋病奈瑟菌疫苗的研究奠定了基礎(chǔ);2通過對(duì)重組蛋白抗血清與淋病奈瑟菌全細(xì)胞抗原的間接ELISA反應(yīng),發(fā)現(xiàn)經(jīng)反向疫苗學(xué)預(yù)測(cè)為外膜蛋白的兩個(gè)重組蛋白(YP_207701.1和YP_207398.1)抗血清都能與淋病奈瑟菌全細(xì)胞抗原反應(yīng),重組蛋白YP_207701.1免疫組抗血清的抗體效價(jià)顯著高于YP_207398.1免疫組,而預(yù)測(cè)為非外膜蛋白的重組蛋白(YP_207727.1)抗血清不能與淋病奈瑟菌全細(xì)胞抗原反應(yīng),初步表明兩個(gè)重組蛋白位于淋病奈瑟菌的細(xì)胞表面,具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。3本研究為反向疫苗學(xué)預(yù)測(cè)出的候選外膜蛋白的實(shí)驗(yàn)篩選提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和方法,也為淋病奈瑟菌反向候選疫苗的研究提供了一個(gè)新的思路。
【關(guān)鍵詞】：淋病奈瑟菌 外膜蛋白 原核表達(dá) 包涵體純化 免疫原性 免疫反應(yīng)性 膜定位
【學(xué)位授予單位】：大理大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-14
• 材料14-21
• 技術(shù)路線21-22
• 第一部分 反向外膜蛋白候選抗原基因的克隆和表達(dá)22-42
• 1 引言22-23
• 2 方法23-32
• 3 結(jié)果32-40
• 4 討論40-41
• 5 小結(jié)41-42
• 第二部分 候選重組外膜蛋白的純化及其免疫原性和表達(dá)定位的初步研究42-51
• 1 引言42-43
• 2 方法43-46
• 3 結(jié)果46-48
• 4 討論48-50
• 5 小結(jié)50-51
• 總結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 附錄55-64
• 文獻(xiàn)綜述64-73
• 參考文獻(xiàn)71-73
• 致謝73

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