本文關(guān)鍵詞：一種從大腸桿菌包涵體中分離純化GST-TRAF6融合蛋白的方法

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【摘要】：利用8 mol/L尿素溶液對(duì)表達(dá)在大腸桿菌包涵體中的GST-TRAF6融合蛋白進(jìn)行變性,通過(guò)逐級(jí)稀釋復(fù)性的方法對(duì)尿素溶解后的GST-TRAF6融合蛋白進(jìn)行復(fù)性,將復(fù)性后的GST-TRAF6融合蛋白進(jìn)一步利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂親和層析的方法進(jìn)行分離純化,將分離純化后的蛋白通過(guò)Western blot方法進(jìn)行驗(yàn)證,最后利用體外泛素化反應(yīng)檢測(cè)經(jīng)包涵體變性、復(fù)性和純化后的GST-TRAF6融合蛋白的生物學(xué)活性。經(jīng)過(guò)包涵體變性、梯度稀釋復(fù)性和谷胱甘肽瓊脂糖樹脂親和層析3個(gè)步驟后純化得到純度達(dá)90%以上、濃度為396 ng/μL的蛋白質(zhì)溶液。利用GST蛋白作為對(duì)照,經(jīng)Western blot驗(yàn)證表明,純化得到的蛋白確為GSTTRAF6融合蛋白。進(jìn)一步利用體外泛素化反應(yīng)分析其泛素連接酶活性發(fā)現(xiàn),17 ng/μL濃度的GST-TRAF6融合蛋白能夠以泛素分子作為底物在5 min內(nèi)快速催化自由泛素鏈的生成。結(jié)果表明,表達(dá)在大腸桿菌包涵體中的GST-TRAF6融合蛋白經(jīng)尿素變性溶解后能夠成功復(fù)性并分離純化,在溶解性改變的同時(shí)恢復(fù)了其泛素連接酶活性。為從大腸桿菌包涵體中大規(guī)模分離純化蛋白質(zhì)提供了一種新的復(fù)性方法。
【作者單位】： 天津商業(yè)大學(xué)
【關(guān)鍵詞】： TRAF 蛋白純化 包涵體復(fù)性 重組蛋白
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81101220) 天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(12JCQNJC08100) “十二五”天津市中青年骨干創(chuàng)新人才支持計(jì)劃 天津市教委高等學(xué)�？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目(20130624)
【分類號(hào)】：R392
【正文快照】： 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(Tumornecrosis fac-tor receptor-associated factors,TRAFs)是腫瘤壞死因子(Tumornecrosis factor,TNF)超家族和Toll樣/白細(xì)胞介素-1受體(toll/IL-1 receptor,TIR)超家族重要的接頭分子,在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用[1,2]。TRAFs包括7個(gè)密

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1 陳U，

本文編號(hào)：629511