本文關(guān)鍵詞：cagA和cagL對(duì)幽門(mén)螺桿菌侵襲細(xì)胞功能的影響

  更多相關(guān)文章： 幽門(mén)螺桿菌 cagA cagL β1整合素 細(xì)胞侵襲

【摘要】：目的:幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)可以侵入胃黏膜上皮細(xì)胞并在胃上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖進(jìn)而參與致病作用。但幽門(mén)螺桿菌侵襲胃黏膜上皮細(xì)胞的機(jī)制尚不明確。研究已證實(shí)細(xì)胞的β1整合素可介導(dǎo)Hp侵入細(xì)胞,但尚不清楚細(xì)菌與侵襲相關(guān)的毒力因子。鑒于此,本研究將從已知幽門(mén)螺桿菌的Cag A和Cag L能與β1整合素結(jié)合為切入點(diǎn),探究cag A和cag L兩基因?qū)p侵襲細(xì)胞功能的影響,旨在揭示與Hp侵襲細(xì)胞功能相關(guān)的毒力因子。方法:1、幽門(mén)螺桿菌NCTC11637cag L缺失株的構(gòu)建參考NCBI Hp J99全基因組序列,設(shè)計(jì)NCTC11637cag L同源臂,將卡那霉素抗性基因(kanaR)連接到PCR擴(kuò)增cag L基因兩端區(qū)域產(chǎn)生的兩個(gè)同源臂之間,而后插入p Bluescript SKⅡ(-)載體中,構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標(biāo)志的重組質(zhì)粒。運(yùn)用基因同源重組方法,將此重組質(zhì)粒通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到NCTC11637中,以卡那霉素抗性基因替換cag L基因,通過(guò)卡那霉素羊血平板篩選出NCTC11637cag L缺失株,命名為NCTC11637Δcag L,傳25代,經(jīng)尿素酶和PCR鑒定,以證實(shí)遺傳穩(wěn)定性。2、AGS細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞β1整合素表達(dá)驗(yàn)證采用Trizol法提取兩株細(xì)胞的總RNA,通過(guò)RT-PCR獲得c DNA,以此為模板PCR,對(duì)β1整合素進(jìn)行m RNA水平表達(dá)驗(yàn)證;利用膜蛋白提取試劑盒提取兩株細(xì)胞總膜蛋白,用抗β1整合素抗體進(jìn)行western blot對(duì)β1整合素進(jìn)行蛋白水平表達(dá)驗(yàn)證。3、cag A和cag L對(duì)幽門(mén)螺桿菌侵襲AGS細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞功能的影響以NCTC11637、NCTC11637Δcag L和NCTC11637Δcag A(由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存)感染AGS細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞(MOI=50,MOI為細(xì)菌數(shù)和細(xì)胞數(shù)的比值),一部分細(xì)胞于感染2h后洗滌裂解,裂解物涂布細(xì)菌培養(yǎng)板,培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),此為粘附細(xì)胞細(xì)菌數(shù);另一部分細(xì)胞感染2h后,利用慶大霉素保護(hù)性侵襲實(shí)驗(yàn),2h后,裂解細(xì)胞,裂解物涂布細(xì)菌培養(yǎng)板,培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),此為侵入細(xì)胞菌數(shù)。通過(guò)計(jì)算侵襲粘附比反映cag A和cag L對(duì)幽門(mén)螺桿菌侵襲能力的影響,侵襲粘附比=(侵入細(xì)胞菌數(shù)/粘附細(xì)胞菌數(shù))×100%。4、cag A和cag L對(duì)幽門(mén)螺桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活時(shí)間的影響以NCTC11637、NCTC11637Δcag L和NCTC11637Δcag A感染AGS細(xì)胞(MOI=50),利用慶大霉素保護(hù)性侵襲實(shí)驗(yàn),以含慶大霉素25μg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng),分別在24h,36h,48h,72h,96h終止實(shí)驗(yàn),進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果:1、利用同源重組基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建了幽門(mén)螺桿菌NCTC11637 cag L缺失株NCTC11637Δcag L;經(jīng)傳25代,尿素酶和PCR鑒定,證明缺失突變株穩(wěn)定;2、AGS細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞均可以表達(dá)β1整合素,相對(duì)灰度值結(jié)果表明,AGS細(xì)胞β1整合素表達(dá)(6.387±2.957)高于SGC7901細(xì)胞(4.442±2.382);3、cag A和cag L對(duì)幽門(mén)螺桿菌侵襲AGS細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞功能的影響(1)NCTC11637對(duì)AGS細(xì)胞的侵襲作用(28.285±4.646%)強(qiáng)于SGC7901細(xì)胞(0.194±0.038%);(2)AGS細(xì)胞中,NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵襲粘附比分別為28.285±4.646%、9.055±3.104%和9.225±0.417%,NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵襲粘附比均顯著低于NCTC11637(P0.05),NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L侵襲粘附比差異無(wú)顯著性;(3)SGC7901細(xì)胞中,NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵襲粘附比分別為0.194±0.038%、0.029±0.007%和0.061±0.009%,NCTC11637Δcag A的侵襲粘附比顯著低于NCTC11637(P0.01),NCTC11637Δcag L的侵襲粘附比顯著低于NCTC11637(P0.05)。4、NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L感染AGS細(xì)胞后,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)逐漸減少,NCTC11637Δcag L在胞內(nèi)可存活72h,NCTC11637Δcag A和NCTC11637可存活48h。結(jié)論:1、AGS細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞均表達(dá)β1整合素,AGS細(xì)胞β1整合素的表達(dá)量高于SGC7901細(xì)胞。2、幽門(mén)螺桿菌對(duì)AGS細(xì)胞的侵襲作用強(qiáng)于SGC7901細(xì)胞。3、cag A和cag L與幽門(mén)螺桿菌侵襲細(xì)胞功能相關(guān)。4、cag A和cag L缺失后幽門(mén)螺桿菌仍可在細(xì)胞內(nèi)定植存活。
【關(guān)鍵詞】：幽門(mén)螺桿菌 cagA cagL β1整合素 細(xì)胞侵襲
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 附錄一 英文縮略語(yǔ)4-5
• 附錄二 試劑配方5-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-37
• 結(jié)果37-46
• 討論46-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 綜述53-65
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 致謝65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：623614