本文關(guān)鍵詞：ABCG2表達(dá)變化對(duì)結(jié)直腸癌模型癌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子水平的影響

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【摘要】：背景與目的結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是最常見的惡性腫瘤之一,在我國(guó)常見惡性腫瘤中其死亡率位列第五。2015年國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)政醫(yī)管局、中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)制訂的《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范》指出,我國(guó)2011年結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別為23.03/10萬(wàn)和11.11/10萬(wàn)。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。流行病學(xué)和腫瘤分子生物學(xué)表明氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)、炎癥與結(jié)直腸癌之間密切相關(guān)。氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)產(chǎn)生或釋放的氧自由基、炎性細(xì)胞因子和趨化因子可誘導(dǎo)DNA損傷、細(xì)胞增生和血管生成而促發(fā)腫瘤。細(xì)胞膜三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員G2 (ATP-binding cassette family G2, ABCG2)是一種由655個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜糖蛋白,其編碼基因位于人類染色4q22,屬ABC基因家族。目前關(guān)于結(jié)直腸癌中ABCG2的研究主要涉及其作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)子與化療耐藥機(jī)制的關(guān)系,至于其它方面作用了解甚少。本課題組前期體外研究首次發(fā)現(xiàn)ABCG2具有保護(hù)結(jié)直腸細(xì)胞免受活性氧(reactive oxygen species, ROS)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷作用,該效應(yīng)可能與ABCG2抑制細(xì)胞核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)信號(hào)通路及抑制相關(guān)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步觀察了人結(jié)直腸癌裸鼠模型中ABCG2表達(dá)變化對(duì)體內(nèi)組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子水平的影響,為結(jié)直腸癌靶向治療提供新靶點(diǎn)和理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法1、常規(guī)培養(yǎng)LoVo.HCT-116、HT-29三種人結(jié)腸癌細(xì)胞株。采用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)不同細(xì)胞株中ABCG2蛋白表達(dá)情況。從中選擇較高表達(dá)ABCG2的人結(jié)腸癌細(xì)胞作為后續(xù)研究對(duì)象。2、采用shRNA慢病毒干擾系統(tǒng)抑制所選細(xì)胞株癌細(xì)胞內(nèi)ABCCG2的表達(dá)(shABCG2組細(xì)胞),同時(shí)設(shè)立僅轉(zhuǎn)染病毒載體的陰性對(duì)照組(shcont組細(xì)胞)。利用熒光顯微鏡觀察病毒感染效率,采用Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中ABCG2蛋白水平,驗(yàn)證ABCG2沉默效果。選擇合適的病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)及感染時(shí)間進(jìn)行后續(xù)研究。3、采用不同濃度(0、0.5、1.0mM;)H2O2處理兩組細(xì)胞4 h,用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測(cè)試劑盒和總谷胱甘肽(total glutathione)檢測(cè)試劑盒,分別測(cè)定兩組細(xì)胞內(nèi)SOD、總谷胱甘肽含量(GSH+GSSG)及谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)活力；同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡狀況。4、將shABCG2組細(xì)胞或shcont組細(xì)胞分別注入裸鼠皮下,建立人結(jié)直腸癌小鼠模型(分別為shABCG2組小鼠與shcont組小鼠)。5、采用免疫熒光檢測(cè)法測(cè)定兩組小鼠移植瘤新鮮組織標(biāo)本中ROS水平變化。6、采用總谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒測(cè)定兩組小鼠移植瘤新鮮組織標(biāo)本中總谷胱甘肽及GRJ水平。7、采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測(cè)兩組小鼠移植瘤新鮮組織中白介素8(interleukin-8, IL-8)與腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、血清中白介素-6(interleukin-6, IL-6)水平;采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time RT-PCR)檢測(cè)兩組小鼠移植瘤新鮮癌組織標(biāo)本中IL-8、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因p(growthregulated oncogene-β, GRO-β) mRNA水平。8、采用Western blot及免疫組化法檢測(cè)兩組小鼠移植瘤新鮮組織中IκB-β和磷酸化IκB-β (phospho-IκB, p-IλB-α)表達(dá)狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、三株人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ABCG2蛋白存在不同程度的表達(dá),以HT-29細(xì)胞株ABCG2表達(dá)相對(duì)較高,故選擇HT-29進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、熒光顯微鏡檢測(cè)可見細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒效率達(dá)90%以上,Western blot結(jié)果顯示shABCG2組細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)水平明顯低于shcont組細(xì)胞,表明ABCG2-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染能有效地抑制5hABCG2組細(xì)胞內(nèi)ABCG2表達(dá),同時(shí)確定MOI值為20,轉(zhuǎn)染時(shí)間為24h。3、與H2O2(0mM)未處理比較,0.5 mM或1.0mMH2O2處理兩組細(xì)胞4h后,細(xì)胞內(nèi)SOD與總谷胱甘肽水平均降低；而與shcont組細(xì)胞比較,0.5 mM或1.0mMH2O2處理shABCG2組細(xì)胞后SOD與總谷胱甘肽含量降低更明顯。同時(shí),隨著H202處理濃度增加,兩組細(xì)胞凋亡數(shù)也增多,但shABCG2組細(xì)胞凋亡程度均低于shcont組細(xì)胞。4、與shcont組小鼠比較,shABCG2組小鼠移植瘤組織中ROS含量明顯增加。5、與shcont組小鼠比較,shABCG2組小鼠移植瘤組織中總谷胱甘肽含量和GR活力下降。6、與shcont組小鼠比較,shABCG2組小鼠移植瘤組織中IL-8、TNF-α水平明顯增高,血清中IL-6含量明顯增高。7、與shcont組小鼠比較,shABCG2組小鼠移植瘤組織中IL-8 mRNA水平未見變化,(GRO-β mRNA水平明顯增高。8、與shcont組小鼠比較,shABCG2組小鼠移植瘤組織中IκB-β表達(dá)下降,β-IκB蛋白表達(dá)上升。結(jié)論1、ABCG2可降低HT-29結(jié)直腸癌細(xì)胞及其裸鼠移植瘤組織中的氧化應(yīng)激水平；2、ABCG2可抑制HT-29結(jié)直腸癌細(xì)胞及其裸鼠移植瘤組織與血清中相關(guān)炎癥因子水平；3、ABCG2可抑制HT-29結(jié)直腸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中NF-κB信號(hào)通路；4、ABCG2可促進(jìn)HT-29結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)直腸癌 ABCG2 氧化應(yīng)激 炎癥因子 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34;R-332
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 縮略語(yǔ)(Abbreviations)12-13
• 前言13-15
• 第一章 材料與方法15-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑15-18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-28
• 第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-43
• 2.1 HT-29細(xì)胞中ABCG2表法水平較高28
• 2.2 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染能有效抑制HT-29細(xì)胞中ABCG2表達(dá)28-29
• 2.3 shABCG2組細(xì)胞中SOD活性明顯降低29
• 2.4 shABCG2組細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘態(tài)水平顯著下降29-30
• 2.5 shABCG2組細(xì)胞調(diào)亡率明顯降低30-31
• 2.6 SHABCG2組小鼠瘤組織中ROS含量增加、總谷胱甘肽含量與GR降低31-32
• 2.7 shABCG2組小鼠組織中比IL-8、TNF-α與IL-6含量明顯增加32-33
• 2.8 shABCG2組瘤組織中IL-8、GRO-β mRNA水平增加33
• 2.9 shABCG2瘤組織中IkB-α水平降化、磷酸化IkB-α水平增高33-35
• 討論35-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 第三章 文獻(xiàn)綜述 氧化應(yīng)激與消化道疾病研究進(jìn)展43-54
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54-55
• 作者簡(jiǎn)介55-56
• 附錄(已發(fā)表和已投稿文章)56-62

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