本文關(guān)鍵詞：EGCG棕櫚酸酯體外抗HCV作用及機(jī)理研究

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【摘要】：人類(lèi)是地球上的重要成員,在影響環(huán)境的同時(shí)也被環(huán)境影響。病原體通過(guò)破壞人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)致使疾病發(fā)生。丙型肝炎病毒就是一種病毒性病原體,具有全球流行性的單鏈RNA病毒,根據(jù)其基因組變異區(qū)域的序列可將其分為6個(gè)基因型以及近百種基因亞型。病毒進(jìn)入人體后有較長(zhǎng)的潛伏期,特異性侵入肝細(xì)胞通過(guò)增殖改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡,使細(xì)胞功能出現(xiàn)紊亂甚至喪失,由慢性肝炎逐漸發(fā)展為肝硬化、肝癌以及爆發(fā)性肝衰竭,導(dǎo)致肝功能的徹底喪失,最終奪走人類(lèi)的生命。本研究通過(guò)對(duì)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸棕櫚酸酯(EGCG棕櫚酸酯)體外抗丙型肝炎病毒的效果的檢測(cè),確定EGCG棕櫚酸酯的抗病毒作用。采用分子生物學(xué)的試驗(yàn)手段從細(xì)胞水平和分子水平探討研究EGCG棕櫚酸酯與肝細(xì)胞以及病毒三者之間相互作用的機(jī)理。首先,采用CCK-8試劑盒檢測(cè)脂溶性EGCG棕櫚酸酯對(duì)Huh7.5.1的毒性作用,丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒測(cè)量擴(kuò)增病毒的滴度,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用于實(shí)驗(yàn)的最佳病毒感染復(fù)數(shù)(multiple of infection, MOI),進(jìn)而研究藥物抗病毒的作用效果。通過(guò)免疫蛋白印記法(western bloting)檢測(cè)EGCG棕櫚酸酯對(duì)細(xì)胞干擾素通路STAT2蛋白的磷酸化水平作用,以及干擾熱休克蛋白成員——HSPA5表達(dá),檢測(cè)EGCG棕櫚酸酯抗病毒的作用效果,確定藥物抗病毒的作用途徑。結(jié)果：0-50μg/mL的EGCG棕櫚酸酯對(duì)Huh7.5.1沒(méi)有毒害作用,EGCG棕櫚酸酯具有明顯的預(yù)防細(xì)胞感染病毒以及抑制病毒增殖的作用,但是預(yù)防效果與藥物添加濃度無(wú)明顯相關(guān)性；而隨藥物濃度增加EGCG棕櫚酸酯抑制病毒增殖的效果增強(qiáng),當(dāng)濃度為25μg/mL時(shí)抑制效果最佳,此時(shí)病毒表達(dá)量是陽(yáng)性對(duì)照組表達(dá)量的1/6。研究還發(fā)現(xiàn),低濃度藥物持續(xù)刺激感染病毒的細(xì)胞能更大的降低病毒的增殖,同時(shí),IFN-α的連續(xù)刺激感染細(xì)胞,丙型肝炎病毒的基因表達(dá)量是陰性對(duì)照的1/2,這很好的證明了臨床上IFN-α對(duì)于丙肝患者治療的有效率不足50%這一現(xiàn)象。我們推測(cè)EGCG棕櫚酸酯能替代傳統(tǒng)干擾素成為有效治療藥物治愈疾病。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGCG棕櫚酸酯能對(duì)STAT2蛋白進(jìn)行磷酸化修飾,慢病毒包裝干擾HSPA5蛋白的表達(dá)降低病毒的增殖,同時(shí)發(fā)現(xiàn)EGCG棕櫚酸酯的抗病毒作用也有所降低。我們推測(cè)HSPA5是丙型肝炎病毒增殖過(guò)程中起著重要促進(jìn)作用的宿主因子,干擾蛋白的表達(dá)則能大大降低病毒的增殖能力。EGCG棕櫚酸酯的抗病毒作用可能是通過(guò)修飾STAT2激活干擾素通路的抗病毒基因表達(dá)正向抑制病毒的增殖,同時(shí)特異性與HSPA5結(jié)合降低蛋白的活性負(fù)向抑制病毒增殖,兩條途徑共同作用實(shí)現(xiàn)抗病毒作用的。由于細(xì)胞生存在微觀與精密并存的環(huán)境中,EGCG棕櫚酸酯實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)抗病毒的作用的途徑并非簡(jiǎn)單兩個(gè)蛋白的改變而已,希望本研究為人類(lèi)克服丙型肝炎病毒提供依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：EGCG棕櫚酸酯 丙型肝炎病毒 Huh7.5.1 293T 實(shí)時(shí)熒光定量PCR CCK-8試劑盒 轉(zhuǎn)染 慢病毒包裝
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R373.21
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 第1章 緒論9-17
• 1.1 引言9-11
• 1.2 課題來(lái)源11
• 1.3 研究背景11-13
• 1.3.1 感染者的全球分布11-12
• 1.3.2 傳播途徑及危害12-13
• 1.4 研究現(xiàn)狀13-14
• 1.5 研究主要內(nèi)容和目標(biāo)14-17
• 第2章 各研究階段的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備17-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器18-20
• 2.1.1 試驗(yàn)材料18
• 2.1.2 配制溶液18-19
• 2.1.3 購(gòu)買(mǎi)試劑、儀器19-20
• 2.2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)20
• 2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR20-21
• 2.4 制備大腸桿菌感受態(tài)21-22
• 2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡22-23
• 2.6 結(jié)果分析23-25
• 2.6.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析23-24
• 2.6.2 蛋白質(zhì)免疫印跡24-25
• 第3章 毒性試驗(yàn)及病毒感染復(fù)數(shù)的測(cè)定25-31
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器26
• 3.2 EGCG棕櫚酸酯的細(xì)胞毒性試驗(yàn)26
• 3.3 病毒擴(kuò)增及濃度測(cè)定26-28
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-29
• 3.4.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)28
• 3.4.2 病毒濃度及感染復(fù)數(shù)測(cè)定28-29
• 3.5 討論29-31
• 第4章 EGCG櫚酸酯抗丙型肝炎病毒的作用31-35
• 4.1 材料31
• 4.2 藥物抗病毒作用的檢測(cè)31-32
• 4.3 結(jié)果32-33
• 4.4 討論33-35
• 第5章 抗病毒機(jī)理研究——干擾素通路35-39
• 5.1 儀器和試劑36
• 5.2 干擾素通路啟動(dòng)子激活效果的檢測(cè)36
• 5.3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)STAT236-37
• 5.4 結(jié)果37-38
• 5.4.1 啟動(dòng)子檢測(cè)結(jié)果37
• 5.4.2 蛋白檢測(cè)結(jié)果37-38
• 5.5 討論38-39
• 第6章 抗病毒機(jī)理研究——HSPA5蛋白39-48
• 6.1 材料39-40
• 6.1.1 HSPA5干擾序列39
• 6.1.2 主要試劑39
• 6.1.3 質(zhì)粒39-40
• 6.2 構(gòu)建干擾質(zhì)粒40-41
• 6.3 篩選干擾細(xì)胞系41-42
• 6.4 藥物與病毒處理干擾細(xì)胞系42
• 6.5 結(jié)果42-46
• 6.5.1 質(zhì)粒構(gòu)建42-43
• 6.5.2 轉(zhuǎn)染43-44
• 6.5.3 干擾效果的檢測(cè)44-45
• 6.5.4 藥物與病毒處理篩選細(xì)胞系45-46
• 6.6 討論46-48
• 第7章 總結(jié)與討論48-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 致謝56-57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉帥華;李春英;李朝;劉德曼;施昆明;趙春建;;EGCG及其衍生物的抗病毒作用研究進(jìn)展[J];黑龍江醫(yī)藥;2013年01期

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本文編號(hào)：528578