本文關(guān)鍵詞：利用大腸桿菌合成糖蛋白并對糖鏈長短的調(diào)節(jié)進行初步探索

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【摘要】：脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌外璧層中特有的一種化學(xué)成分,由類脂A(內(nèi)毒素)、核心多糖和O抗原三部分組成。O抗原由多個結(jié)構(gòu)相同的重復(fù)糖單位構(gòu)成,屬于多糖抗原。根據(jù)糖鏈的長短,一般可將O抗原劃分為long型(19-25個重復(fù)糖單位)、intermediate型(10-18個重復(fù)糖單位)和short型(10個重復(fù)糖單位)三種類型。不同菌株的O抗原,糖重復(fù)單位個數(shù)有所差別,構(gòu)成重復(fù)糖單位的單糖個數(shù)、單糖種類及糖苷鍵的類型也有較大差異。脂多糖能夠刺激人體的免疫系統(tǒng),引起機體產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)。鑒于脂多糖在機體免疫中的重要作用,利用病原菌的脂多糖尤其是O抗原可以進行糖疫苗的研發(fā)。O抗原糖鏈的大小與致病菌的抗原性密切相關(guān)。O抗原位于細(xì)菌表面,能夠影響部分分泌蛋白的功能,進而影響細(xì)菌的毒力。O抗原與細(xì)菌的致病性密切相關(guān),在細(xì)菌信號識別、黏附、免疫逃避等過程中發(fā)揮著重要作用。對于致病菌而言,O抗原糖鏈越長,對血清的耐受性就越強。根據(jù)合成機制(主要指反轉(zhuǎn)酶)的不同,O抗原的合成可劃分為三種,分別為依賴Wzy的合成途徑、依賴于ABC運轉(zhuǎn)器的合成途徑和依賴于合成酶的合成途徑。Wzy依賴機制中存在一種重要的調(diào)節(jié)蛋白Wzz,負(fù)責(zé)0抗原糖鏈長短的調(diào)節(jié)。在Wzz的作用下,O抗原糖鏈具有一定的大小特異性。通過Wzz蛋白對O抗原糖鏈的大小進行改造可改變O抗原的抗原性,進而開發(fā)具有特定效力的糖疫苗。隨著細(xì)菌N-糖基化系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),O抗原與免疫蛋白載體在細(xì)菌中結(jié)合成為了可能。本論文第二章主要是關(guān)于糖蛋白生物合成的研究,糖蛋白中的糖成分來自于E. coli O157:H7的O抗原。首先,利用Red同源重組系統(tǒng)對E. coli W3110菌株的waal基因進行敲除；其次,構(gòu)建了含有E. coli O157:H7 O抗原基因簇的載體pYES1L-O157 rfp;MBP作為疫苗的受體蛋白時,其本身具有結(jié)合(Toll-like receptor 4)TLR4的能力,并促進細(xì)胞因子的活化,激活人體的抗原呈遞細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞,激發(fā)人體特異的免疫應(yīng)答和免疫記憶,MBP表達量大,易于純化及驗證�；贛BP的上述優(yōu)點,選擇該蛋白作為PglB催化的N-糖基化途徑的受體蛋白。為了提高糖基化的效率,將pglb基因和C末端加入了4個連續(xù)DQNAT糖基化位點的mbp基因克隆到pBAD24載體中。最后,構(gòu)建了糖蛋白的表達菌株并進行糖蛋白的純化,對純化的蛋白進行了Western blot驗證及MALDI-TOF-MS驗證。與目前的化學(xué)交聯(lián)方法相比,利用生物學(xué)方法獲得的糖-蛋白綴合物疫苗具有高均質(zhì)性、無污染、一次發(fā)酵、便于純化等優(yōu)點,具有化學(xué)方法不可比擬的優(yōu)勢。本論文第三章主要是關(guān)于糖蛋白糖鏈長短的研究,通過糖鏈的長短來調(diào)解糖蛋白的免疫原性。首先,利用Red同源重組系統(tǒng)對E.coli W3110Awaal菌株的wzz基因進行敲除；其次,跟據(jù)O抗原糖鏈大小,選擇了E.coli O111(長),E. coli 0127(長)和E. coli O86:H2(中)菌株的wzz基因進行克隆,分別構(gòu)建到pEXT22載體上；第三,利用同源重組技術(shù)可以對E.coli O157:H7O抗原的基因簇進行克隆,該基因簇中不包含wzz基因。最后,分別構(gòu)建表達不同糖鏈長短糖蛋白的菌株并進行糖蛋白的純化。
【關(guān)鍵詞】：糖蛋白 O抗原 wzz基因 同源重組
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-15
• 符號說明15-17
• 第一章 緒論17-37
• 1.1 糖類概述18-20
• 1.1.1 糖的定義及分類18
• 1.1.2 細(xì)菌多糖18-19
• 1.1.3 大腸桿菌脂多糖19-20
• 1.2 大腸桿菌O抗原20-25
• 1.2.1 大腸桿菌O抗原的結(jié)構(gòu)20-21
• 1.2.2 大腸桿菌合成O抗原的基因簇21-22
• 1.2.3 大腸桿菌O抗原的合成過程22-23
• 1.2.4 Wzz簡介23-25
• 1.3 N-連接糖基化系統(tǒng)25-28
• 1.3.1 真核生物N-連接糖基化25-26
• 1.3.2 原核生物中N-連接糖基化26-27
• 1.3.3 細(xì)菌的寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB27-28
• 1.4 同源重組技術(shù)28-31
• 1.4.1 同源重組技術(shù)簡介28
• 1.4.2 基因敲除的一般步驟28-29
• 1.4.3 同源重組在克隆技術(shù)上的應(yīng)用29-31
• 1.5 糖類疫苗的研究31-33
• 1.5.1 多糖疫苗31-32
• 1.5.2 糖蛋白結(jié)合疫苗32-33
• 1.6 糖蛋白的合成33-37
• 1.6.1 糖蛋白的化學(xué)合成法33
• 1.6.2 糖蛋白的生物合成法33-37
• 第二章 糖蛋白的生物合成37-53
• 2.1 引言37-38
• 2.2 實驗材料38-40
• 2.2.1 菌株和載體38
• 2.2.2 酶和耗材38-39
• 2.2.3 培養(yǎng)基與緩沖液39-40
• 2.2.4 儀器設(shè)備40
• 2.3 實驗方法40-46
• 2.3.1 利用Red同源重組進行基因敲除40-42
• 2.3.2 載體構(gòu)建42-43
• 2.3.3 表達菌株的構(gòu)建及糖蛋白的純化43-46
• 2.4 實驗結(jié)果與討論46-52
• 2.4.1 基因敲除菌株E.coli W3110△waal的構(gòu)建46
• 2.4.2 載體蛋白及糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆46-48
• 2.4.3 載體pYESIL-O157 rfb的構(gòu)建48
• 2.4.4 表達菌株的構(gòu)建及糖蛋白的純化48-50
• 2.4.5 糖蛋白的Western blot驗證50-51
• 2.4.6 糖蛋白的質(zhì)譜分析51-52
• 2.5 本章小結(jié)52-53
• 第三章 糖蛋白糖鏈長短調(diào)節(jié)的初步探索53-67
• 3.1 引言53-54
• 3.2 實驗材料54-55
• 3.2.1 菌株和載體54
• 3.2.2 酶和耗材54
• 3.2.3 儀器設(shè)備54-55
• 3.2.4 培養(yǎng)基與緩沖液55
• 3.3 實驗方法55-61
• 3.3.1 利用Red同源重組進行基因敲除55-56
• 3.3.2 載體構(gòu)建56-57
• 3.3.3 利用RedE/T技術(shù)直接克隆大片段57-59
• 3.3.4 利用同源重組技術(shù)對載體進行修飾59-60
• 3.3.5 LPS的提取及銀染60-61
• 3.4 實驗結(jié)果與討論61-66
• 3.4.1 基因敲除菌株E. coli W3110△waal△wzz的構(gòu)建61-62
• 3.4.2 不同來源wzz基因的克隆62
• 3.4.3 E. coli O157：H7O抗原基因簇的構(gòu)建(不含wzz基因)62-64
• 3.4.4 p15A-157 antigen載體的表達驗證64-65
• 3.4.5 p15A-157 antigen載體的修飾65-66
• 3.5 本章小結(jié)66-67
• 全文總結(jié)67-69
• 參考文獻69-77
• 致謝77-79
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文79-80
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表80

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