本文關(guān)鍵詞：兩種乳酸桿菌的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能研究

  更多相關(guān)文章： S-層蛋白 細(xì)胞增殖 免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞凋亡

【摘要】：S-層蛋白是位于一些細(xì)菌細(xì)胞壁外層的一種蛋白成分。乳酸桿菌的S-層蛋白對(duì)其發(fā)揮益生功能具有重要作用。許多研究證實(shí)乳酸菌定殖于宿主腸道中,能夠?qū)λ拗鞯拿庖呦到y(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。而S-層蛋白作為其最外層成分,其參與乳酸桿菌拮抗病原菌黏附及入侵宿主細(xì)胞、保護(hù)乳酸桿菌在胃腸道中維持正常的生物活性等方面具有重要作用。但是,目前關(guān)于S-層蛋白對(duì)宿主細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究較少,所以本課題以宋內(nèi)志賀菌作為炎性刺激物,研究從Lactobacillus paracasei subsp.paracasei M5-L和Lactobacillus casei Q8-L兩種乳酸桿菌上分離的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。采取5 mol/L的LiCl提取S-層蛋白,并利用1 mol/L的LiCl通過(guò)鹽析的方法來(lái)純化粗提蛋白,SDS-PAGE檢測(cè)表明兩株菌均在45 kDa處有單一條帶。調(diào)整S-層蛋白濃度作用細(xì)胞,經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)最終確定其作用濃度為100μg/mL,Shigella sonnei與細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)為20:1,作用時(shí)間為6 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了兩種S-層蛋白能夠抑制S.sonnei對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響,在作用時(shí)間為6 h時(shí),預(yù)防組及治療組具有明顯的效果;在作用時(shí)間為12 h時(shí),則為競(jìng)爭(zhēng)組的效果較好。通過(guò)對(duì)倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的觀察、臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,再次證實(shí)了S-層蛋白能夠拮抗S.sonnei對(duì)細(xì)胞活性的有害影響。通過(guò)對(duì)細(xì)胞上清液中NO含量的檢測(cè),證明兩種S-層蛋白能夠降低S.sonnei引起的細(xì)胞過(guò)度分泌NO,并且這種抑制作用與濃度有關(guān)。通過(guò)ELISA測(cè)定細(xì)胞分泌的IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的水平及RT-PCR對(duì)相應(yīng)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)情況的研究,證實(shí)了兩種S-層蛋白能夠在基因及蛋白水平誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子IL-10,同時(shí)能夠在基因及蛋白水平拮抗S.sonnei刺激細(xì)胞分泌的促炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-α、IL-1β。進(jìn)一步通過(guò)Western Blot法對(duì)HT-29細(xì)胞的MAPK信號(hào)通路進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)兩種S-層蛋白能夠通過(guò)降低p-JNK蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而拮抗S.sonnei對(duì)JNK信號(hào)通路的活化作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了S-層蛋白能夠通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子及信號(hào)通路的調(diào)節(jié),進(jìn)而對(duì)宿主細(xì)胞的免疫作用進(jìn)行調(diào)控。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT-29細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況,證實(shí)兩種S-層蛋白均能夠調(diào)節(jié)S.sonnei導(dǎo)致的細(xì)胞周期紊亂的狀態(tài),并對(duì)S.sonnei誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞大量增加的情況進(jìn)行抑制,進(jìn)一步證實(shí)了S-層蛋白能通過(guò)對(duì)S.sonnei的抑制作用進(jìn)而保護(hù)宿主細(xì)胞。研究也表明S-層蛋白能夠通過(guò)拮抗細(xì)胞Caspase-1的活性,進(jìn)而抑制S.sonnei引起的細(xì)胞炎性,通過(guò)對(duì)Caspase-3活性的降低,進(jìn)而減少S.sonnei引起的細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：S-層蛋白 細(xì)胞增殖 免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R37
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-18
• 1.1 課題來(lái)源及研究的背景意義11-12
• 1.2 乳酸桿菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.3 乳酸桿菌S-層蛋白的功能13-14
• 1.3.1 S-層蛋白對(duì)膽鹽及消化酶的耐受能力13
• 1.3.2 S-層蛋白參與乳酸桿菌對(duì)宿主的黏附作用13-14
• 1.3.3 S-層蛋白抑制病原菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附及侵入作用14
• 1.4 乳酸桿菌S-層蛋白的免疫調(diào)控作用14-16
• 1.5 國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)綜述的簡(jiǎn)析16
• 1.6 本課題主要研究?jī)?nèi)容16-17
• 1.7 技術(shù)路線17-18
• 第2章 材料和方法18-31
• 2.1 材料及儀器18-22
• 2.1.1 材料與試劑18-20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器20-22
• 2.1.3 培養(yǎng)基22
• 2.1.4 菌種及細(xì)胞來(lái)源22
• 2.2 乳酸桿菌及S.sonnei的培養(yǎng)22-23
• 2.3 乳酸桿菌S-層蛋白的提取、純化及鑒定23-24
• 2.3.1 乳酸桿菌S-層蛋白的提取23
• 2.3.2 乳酸桿菌S-層蛋白的純化23
• 2.3.3 SDS-PAGE電泳測(cè)定S-層蛋白分子量23-24
• 2.3.4 BCA法測(cè)定S-層蛋白濃度24
• 2.4 乳酸桿菌的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞的干預(yù)處理24-25
• 2.5 MTT法檢測(cè)HT-29細(xì)胞的活性25
• 2.6 臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)25-26
• 2.7 NO試劑盒測(cè)HT-29細(xì)胞上清液中NO的含量變化26
• 2.8 ELISA法測(cè)HT-29細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的含量變化26
• 2.9 RT-PCR法測(cè)定HT-29細(xì)胞中IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)情況26-28
• 2.10 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期28
• 2.11 不同處理對(duì)HT-29細(xì)胞Caspase-1 和Caspase-3 活性的影響28-29
• 2.12 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡29
• 2.13 Western Blot測(cè)定HT-29細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)途徑中ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)量的變化29-30
• 2.14 數(shù)據(jù)處理及繪圖30-31
• 第3章 乳酸桿菌的S-層蛋白抑制S.sonnei對(duì)細(xì)胞增殖作用及形態(tài)影響的研究31-42
• 3.1 乳酸桿菌S-層蛋白的分離純化31-33
• 3.1.1 乳酸桿菌S-層蛋白的SDS-PAGE31-32
• 3.1.2 BCA法測(cè)定乳酸桿菌S-層蛋白的含量32-33
• 3.2 MTT檢測(cè)不同處理下HT-29細(xì)胞活性33-37
• 3.2.1 不同濃度的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞活性的影響33-35
• 3.2.2 不同S.sonnei的感染復(fù)數(shù)對(duì)HT-29細(xì)胞活性的影響35-37
• 3.3 不同處理下的HT-29細(xì)胞學(xué)研究37-39
• 3.4 臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)39-40
• 3.5 本章小結(jié)40-42
• 第4章 乳酸桿菌的S-層蛋白對(duì)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用及對(duì)MAPK信號(hào)通路的研究42-63
• 4.1 兩種S-層蛋白對(duì)S.sonnei誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的抑制作用42-44
• 4.2 ELISA法測(cè)HT-29細(xì)胞上清液中IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的含量變化44-50
• 4.2.1 HT-29細(xì)胞上清液中IL-10的含量44-46
• 4.2.2 HT-29細(xì)胞上清液中IL-8 的含量46-47
• 4.2.3 HT-29細(xì)胞上清液中IL-1β的含量47-49
• 4.2.4 HT-29細(xì)胞上清液中TNF-α的含量49-50
• 4.3 RT-PCR法測(cè)定HT-29細(xì)胞中IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)情況50-58
• 4.3.1 HT-29細(xì)胞中IL-10的基因的表達(dá)水平50-51
• 4.3.2 HT-29細(xì)胞中IL-8 的基因的表達(dá)水平51-53
• 4.3.3 HT-29細(xì)胞中IL-1β的基因的表達(dá)水平53-55
• 4.3.4 HT-29細(xì)胞中TNF-α的基因的表達(dá)水平55-58
• 4.4 不同處理時(shí)對(duì)HT-29細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的研究58-61
• 4.4.1 M5-L的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞MAPK通路的影響58
• 4.4.2 Q8-L的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞MAPK通路的影響58-61
• 4.5 本章小結(jié)61-63
• 第5章 乳酸桿菌的S-層蛋白拮抗S.sonnei對(duì)細(xì)胞凋亡的研究63-73
• 5.1 兩種S-層蛋白的不同處理對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響63-65
• 5.2 兩種S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞Caspase-1 和Caspase-3 活性影響65-68
• 5.2.1 不同處理對(duì)HT-29細(xì)胞Caspase-1 活性的研究65-66
• 5.2.2 不同處理對(duì)HT-29細(xì)胞Caspase-3 活性的研究66-68
• 5.3 兩種S-層蛋白的不同處理對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響68-71
• 5.4 本章小結(jié)71-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-83
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文83-85
• 致謝85

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