本文關(guān)鍵詞：HIV-1融合蛋白gp41自然突變及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：HIV包膜蛋白(Env)在病毒入侵過程中起著關(guān)鍵的作用：介導(dǎo)受體結(jié)合和膜融合。研究表明,6-HB的形成是HIV膜融合的關(guān)鍵所在,而來自于NHR和CHR的多肽可以阻斷病毒6-HB的形成,是理想的藥物靶點。基于我們在gp41上發(fā)現(xiàn)的新結(jié)構(gòu)M-T鉤子,我們以模板SC22EK設(shè)計了短小多肽MT-SC22,其具有極高的抑制活性,并且有很高的耐藥基因屏障。前期我們用模板短肽SC22EK及具有高抑制活性的MT-SC22篩選出在gp41保守序列上發(fā)生劇烈的氨基酸突變的兩個氨基酸位點(Glu49、Leu57),分別簡稱為E49K、L57R。本研究對HIV database Env序列進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)在E49位點上出現(xiàn)由E突變?yōu)锳、D、G、K、N、Q、S共七種自然突變；在L57位點上共出現(xiàn)由L突變?yōu)镕、P、R、V四種自然突變。為了更全面地研究L57氨基酸位點的功能,本研究另外加入了L57A突變,一共12組氨基酸突變。本課題以表達(dá)HIV-1毒株NL4-3囊膜蛋白(Env)的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行定點突變,成功獲得了12個系列突變質(zhì)粒。經(jīng)Western Blot和capture ELISA檢測證實這些突變不影響Env的表達(dá)和切割；緊接著我們分析了突變對病毒入侵靶細(xì)胞能力以及膜融合抑制劑抗病毒活性的影響,發(fā)現(xiàn)多個自然突變能夠顯著影響HIV-1的入侵能力,并介導(dǎo)對抑制劑的高度耐藥；同時以NHR多肽N36為模板合成含有以上12種氨基酸突變的系列多肽,比較分析了N36、N36E49-x、 N36L57-X對NL4-3假病毒株的抑制活性以及多肽自身螺旋穩(wěn)定性,結(jié)果顯示突變后的氨基酸對NHR螺旋穩(wěn)定性、NHR螺旋三聚體與CHR親和性都有一定影響。我們從突變點對病毒囊膜蛋白功能、NHR穩(wěn)定性、6-HB穩(wěn)定性和抑制劑親和力四個主要方面,深入探討了HIV-1膜融合抑制劑的耐藥機(jī)制。綜合多方面的研究結(jié)果,本研究得出以下結(jié)論：(1)E49和L57的突變毒株對短肽抑制劑(如SC22、HP23等)有較強(qiáng)的拮抗作用,而對長肽類抑制劑(如T20、SFT)的作用效果不明顯；(2)病毒突變的氨基酸與CHR或抑制劑上相應(yīng)的氨基酸之間的電荷相互作用可以影響抑制劑的效率；另一方面,突變點可以影響病毒與抑制劑整體結(jié)合力；病毒突變后最終表現(xiàn)出的耐藥現(xiàn)象是此兩種因素共同影響下的一個平衡的結(jié)果；(3)病毒的入侵能力與耐藥性的高低基本符合“入侵能力越差耐藥倍數(shù)就越高”這一理論；(4) E49S/N/G三種突變對NHR螺旋穩(wěn)定性的影響是病毒耐藥性的主要影響因素；(5) E49A/Q/D三種突變后的氨基酸電荷對螺旋束整體穩(wěn)定性的影響作用主導(dǎo)了病毒的耐藥表現(xiàn)；(6)脯氨酸(P)屬于亞氨基酸,是α螺旋的破壞者,突變又處于NHR的核心區(qū)域,病毒發(fā)生L57P突變后完全喪失感染能力；(7)L57A/F/V三種突變,由于仍然保持了L57位點的疏水性,所以對短肽的活性影響比較溫和；(8)由于芳香族氨基酸F帶有的苯環(huán)形成空間位阻,減弱了NHR與抑制劑的親和力,所以L57F對C34和SFT呈現(xiàn)弱耐藥。本研究對HIV-1融合蛋白gp41的結(jié)構(gòu)與功能、gp41介導(dǎo)的病毒膜融合機(jī)制、以及抑制劑的耐藥機(jī)制具有重要的科學(xué)意義,為研發(fā)膜融合抑制劑類艾滋病藥物提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 gp41 病毒進(jìn)入 膜融合抑制劑 突變 耐藥機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-15
• 1. 實驗材料15-21
• 1.1. 相關(guān)感受態(tài)和細(xì)胞15
• 1.2. 實驗相關(guān)工具酶和抗體15
• 1.3. 引物15-16
• 1.4. 所用溶液和培養(yǎng)基16-18
• 1.5. 相關(guān)試劑盒18
• 1.6. 實驗相關(guān)多肽18-19
• 1.7. 主要儀器19-21
• 2. 實驗方法21-27
• 2.1. 針對HIV-1 Env gp41蛋白上E49、L57兩位點氨基酸突變頻率的統(tǒng)計21
• 2.2. 以標(biāo)準(zhǔn)實驗株HIVNL4-3的Env質(zhì)粒為模板進(jìn)行氨基酸定點突變21-22
• 2.3. Western Blot檢測Env的表達(dá)情況22-23
• 2.4. Capture ELISA檢測Env的表達(dá)情況23-24
• 2.5. 假病毒的包裝制備24
• 2.6. 功能性假病毒的滴度測定24-25
• 2.7. 假病毒的p24抗原定量25
• 2.8. HIV-1突變假病毒定量單次入侵實驗25
• 2.9. 多肽對HIV-1假病毒的抑制率的檢測25-26
• 2.10. 用圓二色譜儀檢測突變對N肽α螺旋形成和螺旋穩(wěn)定性的影響26-27
• 3. 實驗結(jié)果27-39
• 3.1. E49和L57兩位點氨基酸突變頻率的統(tǒng)計結(jié)果27-30
• 3.2. 點突變后HIV-1 Env的表達(dá)情況30
• 3.3. 突變位點對假毒株入侵靶細(xì)胞能力的影響30-32
• 3.4. 短肽類抑制劑對突變假毒株的抑制情況32-34
• 3.5. 突變假毒株對第一代和新一代膜融合抑制劑的耐藥性檢測34-36
• 3.6. 點突變后對N肽類抑制劑抗病毒活性的影響36-37
• 3.7. CD檢測突變點對NHR螺旋穩(wěn)定性的影響37-39
• 4. 討論39-45
• 5. 小結(jié)45-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 綜述53-65
• 二、前言53-54
• 三、針對HIV-1 gp41的膜融合抑制劑的抗病毒機(jī)制54-55
• 四、N肽類膜融合抑制劑55-56
• 1. 源于NHR序列的N肽類膜融合抑制劑55
• 2. 重組嵌合體N肽類膜融合抑制劑55-56
• 五、C肽類膜融合抑制劑56-60
• 1. 源于CHR序列的C肽類膜融合抑制劑56-57
• 2. 改造的C肽類膜融合抑制劑57-60
• 六、總結(jié)60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 附錄65-71
• 致謝71-73
• 個人簡歷73

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：496700