本文關(guān)鍵詞：5-甲基胞嘧啶羥化酶TET1在肝再生時(shí)卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝臟作為人體一個(gè)重要代謝器官,當(dāng)其受到不同病因的影響導(dǎo)致的肝細(xì)胞受損后,會(huì)發(fā)生不同類型干細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生(liver regeneration)。肝干細(xì)胞主要分為內(nèi)源性干細(xì)胞和外源性干細(xì)胞。其中內(nèi)源性干細(xì)胞主要以卵圓細(xì)胞為主；外源性干細(xì)胞主要來(lái)源于造血干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞,內(nèi)皮祖干細(xì)胞等。卵圓細(xì)胞作為肝臟的成體干細(xì)胞在肝臟再生過(guò)程中發(fā)揮核心作用。肝卵圓細(xì)胞是存在于肝內(nèi)膽管末端赫令管間隙的一類具有多向分化潛能的細(xì)胞群,其在正常情況下呈靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)發(fā)生各種肝臟的損傷后便刺激其增殖分化,形成成熟的肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞,完成肝臟形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上的修復(fù)。目前,關(guān)于卵圓細(xì)胞增殖分化的調(diào)控機(jī)制尚無(wú)定論。因此,探索其新的調(diào)控機(jī)制很有必要。 最新研究報(bào)道,表觀遺傳學(xué)的DNA去甲基化與干細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。其中DNA羥化酶TET1(Ten-eleven translocation1)是催化5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)去甲基化生成5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroymethylcytosine,5hmC)的關(guān)鍵因子,其在胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中具有促進(jìn)干性基因轉(zhuǎn)錄同時(shí)抑制分化基因表達(dá)的雙重作用。即在胚胎干細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中呈下調(diào)趨勢(shì)。但目前TET1調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新和分化發(fā)育的具體機(jī)制還在研究之中,尚不明確。 因此,本課題分以下幾個(gè)部分：1.卵圓細(xì)胞增殖肝再生動(dòng)物模型的建立,即成功建立卵圓細(xì)胞增殖的動(dòng)物模型。2.肝卵圓細(xì)胞的分離、提取、培養(yǎng)及鑒定。獲得大鼠原代卵圓細(xì)胞并鑒定其特異性。3.檢測(cè)TET1在肝再生動(dòng)物模型中的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)TET1在肝再生不同時(shí)間段的表達(dá)變化趨勢(shì)。4.檢測(cè)TET1在卵圓細(xì)胞株WB-F344向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化。通過(guò)建立誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞株WB-F344向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系,觀察TET1在其基因和蛋白水平的表達(dá)變化。通過(guò)上述研究,旨在說(shuō)明：1.TET1在肝再生過(guò)程中的明顯的動(dòng)態(tài)變化。2.TET1在卵圓細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞過(guò)程中明顯下調(diào),從而初步證明TET1可能參與了卵圓細(xì)胞的增殖與肝再生過(guò)程。 方法 1.肝再生動(dòng)物模型建立取重約150-180g SD大鼠,2-AAF10mg/kg·d灌胃4d。第5天行2/3肝切除術(shù),之后繼續(xù)2-AAF灌胃。肝切除術(shù)后第3、6、9、12、15天處死大鼠獲取肝臟標(biāo)本。 2.原代大鼠卵圓細(xì)胞的提取及鑒定原位肝灌注聯(lián)合離體肝灌注法分離大鼠肝臟細(xì)胞,再采用Percoll密度梯度離心法提取目的卵圓細(xì)胞。鑒定方法包括肝卵圓細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定,細(xì)胞特異性標(biāo)記物鑒定等。 3.檢測(cè)TET1在肝再生動(dòng)物模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化包括RT-PCR檢測(cè)TET1在mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化,Western blot檢測(cè)TET1蛋白水平的表達(dá)趨勢(shì)。 4.多種細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)原代大鼠肝卵圓細(xì)胞卵圓細(xì)胞株WB-F344向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化根據(jù)實(shí)驗(yàn)分為二組,原代不加任何細(xì)胞因子培養(yǎng)WB-F344為對(duì)照組,用SCF20ug/L、HGF10ug/L, EGF10ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)7天的WB-F344為實(shí)驗(yàn)組。 5.檢測(cè)誘導(dǎo)前后WB-F344細(xì)胞表達(dá)卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞特異性蛋白通過(guò)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)誘導(dǎo)前后卵圓細(xì)胞特異性抗體OV6,肝細(xì)胞特異性抗體ALB和AFP,膽管上皮細(xì)胞特異性抗體CK19的蛋白水平表達(dá)變化。 6.細(xì)胞免疫熒光、Realtime PCR、Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)前后TET1mRNA和蛋白水平表達(dá)變化。 結(jié)果 1.卵圓細(xì)胞增殖動(dòng)物模型的成功建立。第3、6、9、12、15天取出大鼠剩余肝臟標(biāo)本,可見(jiàn)隨著時(shí)間的推移大鼠腹部切口逐漸愈合,余肝體積增大,直至15天恢復(fù)正常肝臟大小。 2.采用原位肝灌注加離體肝灌注法聯(lián)合Percoll密度梯度離心法獲得的肝卵圓細(xì)胞數(shù)量1.34×105/mL。提取的目的細(xì)胞倒置顯微鏡下可見(jiàn)呈圓球形,培養(yǎng)24h后呈半貼壁狀態(tài)。特異性標(biāo)記物OV6細(xì)胞免疫熒光染色陽(yáng)性,細(xì)胞純度≥80%。 3. RT-PCR、Western blot檢測(cè)TET1在肝再生模型中的基因和蛋白表達(dá)水平。3d組和6d組的TET1基因表達(dá)水平較肝切前對(duì)照組明顯升高(P0.01),與其蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)一致。9d組的表達(dá)量與肝切前表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P0.05)。而肝切后的后期(12、15d)TET1的表達(dá)下調(diào)(P0.05),與其蛋白水平動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)相同。 4.卵圓細(xì)胞株WB-F344經(jīng)過(guò)SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF10ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,與誘導(dǎo)前相比較,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形細(xì)胞或多角形改變,核質(zhì)比減少,形態(tài)類似于培養(yǎng)狀態(tài)下肝細(xì)胞。 5.卵圓細(xì)胞株WB-F344經(jīng)過(guò)SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF lOug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,與對(duì)照組卵圓細(xì)胞特異性抗體OV6染色陽(yáng)性,ALB、AFP呈陰性表達(dá)相比,誘導(dǎo)后的細(xì)胞OV6表達(dá)陰性,且肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物ALB和AFP呈陽(yáng)性表達(dá)。 6.卵圓細(xì)胞株WB-F344經(jīng)過(guò)SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF10ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,TET1轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)(P0.01),細(xì)胞免疫熒光、Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)前后TET1蛋白水平明顯下降與基因水平表達(dá)一致。 結(jié)論 1.通過(guò)2-AAF聯(lián)合2/3肝切除術(shù)成功建立卵圓細(xì)胞增殖的動(dòng)物模型。 2.在肝再生模型中,通過(guò)原代細(xì)胞提取獲得較高數(shù)量和純度的肝卵圓細(xì)胞,證明卵圓細(xì)胞在此過(guò)程中大量增殖。 3.在肝再生動(dòng)物模型中TET1的表達(dá)早期明顯升高,直至肝切術(shù)后第6天到達(dá)峰值,之后TET1表達(dá)隨著肝臟修復(fù)逐漸降低。本結(jié)果與卵圓細(xì)胞在肝再生過(guò)程中的增殖變化較一致,從而證實(shí)TET1與卵圓細(xì)胞增殖過(guò)程的密切相聯(lián)。 4.體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化成為肝細(xì)胞樣細(xì)胞,即在卵圓細(xì)胞干性降低分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的過(guò)程中,TET1表達(dá)水平同時(shí)出現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢(shì),提示TET1與卵圓細(xì)胞的自我更新與分化密切相關(guān),它可能通過(guò)參與了卵圓細(xì)胞的分化調(diào)控從而影響肝臟的再生修復(fù)過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：肝臟再生 卵圓細(xì)胞 細(xì)胞分化 TET1
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R333.4
【目錄】：

• ~.略語(yǔ)表5-6
• Abstract6-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 卵圓細(xì)胞增殖的肝再生動(dòng)物模型的建立15-20
• 2.1 引言15
• 2.2 材料與方法15-18
• 2.3 結(jié)果18-19
• 2.4 討論19-20
• 第三章 肝卵圓細(xì)胞的分離、提取、培養(yǎng)及鑒定20-30
• 3.1 引言20
• 3.2 材料與方法20-27
• 3.3 結(jié)果27-28
• 3.4 討論28-30
• 第四章 TET1在肝再生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化30-38
• 4.1 引言30
• 4.2 材料與方法30-36
• 4.3 結(jié)果36-37
• 4.4 討論37-38
• 第五章 TET1在卵圓細(xì)胞株WB-F344向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)變化38-46
• 5.1 引言38
• 5.2 材料與方法38-41
• 5.3 結(jié)果41-43
• 5.4 討論43-46
• 全文結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 文獻(xiàn)綜述 TET蛋白家族調(diào)控干細(xì)胞的相關(guān)研究進(jìn)展51-59
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 攻讀碩士學(xué)位期間撰寫論文情況59-60
• 致謝60

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