本文關(guān)鍵詞：體內(nèi)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向胸腺上皮細(xì)胞分化的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：干細(xì)胞(stem cell)是一種保留自我更新和多向分化潛能的原始且未特化的細(xì)胞群體,既可以通過細(xì)胞分裂的方式不斷增殖維持自身群體的大小,又可以在特定的條件下分化形成不同的組織細(xì)胞。干細(xì)胞依分化潛能分為全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)和專能干細(xì)胞(unipotent stem cell)三類。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)是受精卵發(fā)育到囊胚階段時(shí),內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass, ICM)中的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞因其全能分化能力而在器官移植、細(xì)胞替代治療和基因治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景,但胚胎干細(xì)胞研究存在的倫理學(xué)爭議、免疫排斥、來源有限等問題又極大地限制了它的發(fā)展和臨床應(yīng)用。因此,科學(xué)家也積極尋求替代胚胎干細(xì)胞的途徑,試圖經(jīng)過重編程的方法誘導(dǎo)已分化的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞。重編程(reprogramming),是指已分化的細(xì)胞恢復(fù)其分化前的功能狀態(tài)的過程。細(xì)胞重編程的方法包括核移植、體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞融合及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)。細(xì)胞核移植技術(shù)就是將供體細(xì)胞核移入同種或異種去核的卵母細(xì)胞中,使已分化的體細(xì)胞核恢復(fù)全能性的技術(shù)。細(xì)胞核移植技術(shù)具有里程碑意義的事件是1997年克隆羊多莉的誕生,研究者利用高度分化的綿羊乳腺上皮細(xì)胞,通過核移植克隆獲得一只雌性綿羊。已分化的體細(xì)胞可以被重編程恢復(fù)全能性進(jìn)而發(fā)育為完整個(gè)體,這說明終末分化的體細(xì)胞仍然具有分化發(fā)育為一個(gè)個(gè)體所需的全套遺傳物質(zhì),在適當(dāng)?shù)臈l件下可以被重新激活。細(xì)胞融合是在自然條件或人工誘導(dǎo)下,兩個(gè)或以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)整體的過程。研究者發(fā)現(xiàn)將終末分化的細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞融合,也能誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程。但是,雜交細(xì)胞在進(jìn)行細(xì)胞分裂的過程中會(huì)發(fā)生核融合、染色體的丟失和重排等異常,這些都限制了細(xì)胞融合技術(shù)的臨床應(yīng)用。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技術(shù)就是通過在已分化的體細(xì)胞中過表達(dá)某些特定的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程獲得多能干細(xì)胞的技術(shù)。這種干細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生長特性、基因表達(dá)、畸胎瘤形成及嵌合體形成等方面都與胚胎干細(xì)胞非常相似。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)不但克服了傳統(tǒng)多能干細(xì)胞研究在倫理學(xué)方面的障礙,還具有來源廣泛、相對容易獲得、能得到個(gè)體或疾病特異的多能干細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。許多學(xué)者致力于誘導(dǎo)iPS細(xì)胞定向分化的研究,已成功將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)元、造血祖細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞等。胸腺是體內(nèi)的中樞性免疫器官,提供復(fù)雜的微環(huán)境調(diào)節(jié)T細(xì)胞的存活、分化、選擇和遷移,是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟的場所,也是自身免疫耐受的中心。胸腺上皮細(xì)胞(thvmic epithelial cells, TECs)是胸腺微環(huán)境最重要的組分,皮質(zhì)上皮細(xì)胞通過陽性選擇過程,使T細(xì)胞獲得主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)限制性抗原識(shí)別能力,而髓質(zhì)上皮細(xì)胞則通過陰性選擇清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞,從而誘導(dǎo)對自身抗原的耐受性。近年來,有關(guān)胸腺移植用于誘導(dǎo)移植物耐受的研究越來越受到重視。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)胸腺在誘導(dǎo)快速穩(wěn)定的免疫耐受形成過程中有重要的作用,且胸腺聯(lián)合移植能誘導(dǎo)受者對異種移植物的免疫耐受。Miyake等發(fā)現(xiàn)接受胸腺移植聯(lián)合骨髓移植的小鼠,移植后T淋巴細(xì)胞的功能恢復(fù)了正常,增強(qiáng)了移植物抗腫瘤效應(yīng)(graft-versus-tumour, GVT)的同時(shí),卻不會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的移植物抗宿主反應(yīng)(graft versus host reaction reaction,GVHR)。胸腺移植在誘導(dǎo)移植耐受方面顯示出誘人的應(yīng)用前景。但是迄今為止,移植所用胸腺都是來自于流產(chǎn)胎兒或是先天性心臟病患兒手術(shù)時(shí)切除的胸腺,而且存在人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)不匹配導(dǎo)致的移植排斥問題,胸腺的來源困難也制約了胸腺移植技術(shù)的廣泛開展。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)的突破,為解決胸腺來源有限及免疫排斥等難題提供了新的契機(jī)。許多報(bào)道已證實(shí)ES細(xì)胞能通過體外或體內(nèi)誘導(dǎo)分化的方法獲得胸腺上皮細(xì)胞。有學(xué)者通過利用某些因子調(diào)控干細(xì)胞內(nèi)胸腺發(fā)育相關(guān)的WNT、BMP、RA等信號(hào)通路,成功誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為胸腺上皮祖細(xì)胞或胸腺上皮祖細(xì)胞樣細(xì)胞,這些細(xì)胞移植入動(dòng)物體內(nèi)后能促進(jìn)宿主的T淋巴細(xì)胞重建。但這種體外誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)環(huán)境成分復(fù)雜,誘導(dǎo)效率較低,而且細(xì)胞的分化水平難以鑒別,將未分化或不完全分化的干細(xì)胞移植入體內(nèi)有導(dǎo)致畸胎瘤的可能。2011年,Isotani等通過囊胚注射構(gòu)建嵌合體的策略成功誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為胸腺組織。這種體內(nèi)誘導(dǎo)分化的方法經(jīng)歷細(xì)胞的正常分化進(jìn)程,不需使用多種外源性因子,減少了細(xì)胞水平的長期而復(fù)雜的操作,所獲得的組織細(xì)胞的安全性和穩(wěn)定性較高。然而,無論是體外或是體內(nèi)誘導(dǎo)分化的方式,國際上尚未見iPS細(xì)胞用于胸腺上皮再生的研究報(bào)道。研究目的：探討一種iPS體內(nèi)誘導(dǎo)分化為胸腺上皮細(xì)胞的方法。將表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的C57BL/6小鼠的iPS細(xì)胞,通過顯微注射的方法,注射到ICR小鼠胚胎的囊胚腔內(nèi),構(gòu)建iPS細(xì)胞嵌合體,再從嵌合子代中獲得iPS細(xì)胞來源的胸腺上皮細(xì)胞,并鑒定iPS來源的胸腺上皮細(xì)胞的功能。為iPS細(xì)胞定向分化的研究及臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法：1.iPS細(xì)胞的培養(yǎng)：iPS細(xì)胞培養(yǎng)于預(yù)先鋪有絲裂霉素處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上,在37℃、5%C02、飽和濕度的條件下培養(yǎng),每日換液,每3d傳代1次。按照1：3到1：8的比例進(jìn)行傳代。用于囊胚注射的iPS細(xì)胞在注射前兩日傳代,注射當(dāng)天用差速貼壁法去除MEF細(xì)胞,將消化成單細(xì)胞的iPS細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中,冰浴備用。2.分離獲得ICR小鼠囊胚：6-8周齡的雌性ICR小鼠,腹腔注射孕馬血清促性腺激素及人絨毛膜促性腺激素刺激超數(shù)排卵,并與育齡公鼠合籠。E3.5即交配后第四天上午處死雌鼠,取出子宮,沖胚獲得胚胎。3.iPS細(xì)胞囊胚注射：將表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的iPS細(xì)胞,通過顯微注射的方法,注射到ICR小鼠E3.5胚胎的囊胚腔內(nèi),每個(gè)囊胚注射10-15個(gè)iPS細(xì)胞,獲得嵌合胚胎。4.將嵌合胚胎移植到代孕雌性ICR小鼠子宮內(nèi),后代在出生后10天左右可通過毛色判定嵌合情況；5.分離嵌合小鼠的胸腺,進(jìn)行石蠟切片HE染色、免疫組織化學(xué)染色及冰凍切片,觀察嵌合體胸腺的形態(tài)學(xué)特征。6.鑒定嵌合體胸腺的功能：將嵌合小鼠的胸腺移植到BALB/c裸小鼠的腎被膜下。移植后4周處死小鼠,取脾臟制成單細(xì)胞懸液,以抗小鼠PE-CD3、FITC-CD4、 APC-CD8單抗染色后流式細(xì)胞儀分析檢查CD4、CD8比例,分析受體小鼠T淋巴細(xì)胞重建情況。研究結(jié)果：1.成功構(gòu)建小鼠iPS細(xì)胞嵌合體：我們用GFP陽性的小鼠iPS細(xì)胞系構(gòu)建嵌合體,然后將嵌合胚胎移植到假孕雌性小鼠的子宮內(nèi)。共移植胚胎363枚,移植后受孕的代孕母鼠在妊娠第17天左右自然分娩,獲得幼崽56只,其中13只為嵌合體。從小鼠的被毛顏色評估,組成小鼠iPS嵌合體的細(xì)胞中,GFP小鼠細(xì)胞所占的比例從5%到90%不等。2.嵌合體胸腺的形態(tài)特征：組織學(xué)觀察顯示,嵌合體胸腺有典型的胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)。冰凍切片,熒光顯微鏡觀察可見嵌合體胸腺表達(dá)綠色熒光蛋白。免疫組化檢測,以K8和K5單抗染色,顯微鏡觀察,可見K8+的皮質(zhì)上皮細(xì)胞、K5+的髓質(zhì)上皮細(xì)胞。3.iPS嵌合體的胸腺促進(jìn)受體T細(xì)胞重建：為了分析iPS嵌合體所形成的胸腺是否有功能,我們把胸腺移植到裸小鼠的腎被膜下。移植前,這些小鼠體內(nèi)無CD4或CD8單陽性細(xì)胞(CD3陽性),移植后6周,受體小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了CD4+CD8-及CD4-CD8+細(xì)胞。結(jié)論：1.通過囊胚注射構(gòu)建嵌合體的體內(nèi)誘導(dǎo)的方法可獲得iPS來源胸腺上皮細(xì)胞。2.iPS細(xì)胞來源的胸腺上皮細(xì)胞能促進(jìn)受體T淋巴細(xì)胞分化發(fā)育。3.體內(nèi)誘導(dǎo)分化獲得iPS來源的胸腺上皮細(xì)胞移植后能在受者體內(nèi)能形成正常的胸腺結(jié)構(gòu)。
【關(guān)鍵詞】：iPS細(xì)胞 囊胚 顯微注射 胸腺 嵌合體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-27
• 一、干細(xì)胞及重編程概述14-15
• 二、iPS細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展15-19
• 三、iPS細(xì)胞的應(yīng)用及存在的問題19-23
• 四、胸腺移植的應(yīng)用及研究進(jìn)展23-27
• 實(shí)驗(yàn)方法27-40
• 第一部分 iPS細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)分化為胸腺上皮細(xì)胞27-34
• 一、試劑與材料27-28
• 二、實(shí)驗(yàn)方法28-34
• 第二部分 iPS來源的胸腺上皮細(xì)胞的鑒定34-40
• 一、試劑與材料34-35
• 二、實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 結(jié)果40-44
• 一、成功構(gòu)建小鼠iPS細(xì)胞嵌合體40
• 二、嵌合體胸腺的形態(tài)特征40-41
• 三、iPS嵌合體的胸腺對受體T細(xì)胞分化發(fā)育的影響41-42
• 四、iPS嵌合體的胸腺在受體體內(nèi)能形成正常的胸腺組織結(jié)構(gòu)42-44
• 討論44-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 攻讀學(xué)位期間成果52-53
• 致謝53-55

  本文關(guān)鍵詞：體內(nèi)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向胸腺上皮細(xì)胞分化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：494128