本文關(guān)鍵詞：兔尿源性干細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及其生物學特性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞基礎(chǔ)療法為尿道組織重建提供了有前景的選擇。有研究發(fā)現(xiàn)人尿液中存在著一種干細胞,后被定義為尿源性干細胞(USCs),這種干細胞具有較強的增殖能力,遺傳穩(wěn)定性好,并可有效分化為尿路上皮細胞和平滑肌細胞,且尿源性干細胞的獲取簡便、無創(chuàng)、成本低廉,這些優(yōu)點為尿路的組織工程重建提供了理想的種子細胞。在相關(guān)的研究中,發(fā)現(xiàn)USCs能促進無胸腺裸鼠腎臟、陰莖海綿體及尿道括約肌等組織的再生。然而,因小鼠體型過小,并不適宜作為尿道重建研究的動物模型。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn),新西蘭大白兔是研究尿道重建的常用動物模型。為避免因異種細胞移植引起排斥反應的發(fā)生,因此有必要采用自體干細胞進行尿道組織重建研究。然而兔尿液中是否存在干細胞,且能否進行分離后培養(yǎng),目前還沒有相應的研究報告。目的：證實兔尿液中存在尿源性干細胞(rabbit Urine-derived Stem Cells, rUSCs),并誘導其分化為尿路上皮細胞及平滑肌細胞,為后續(xù)下尿路組織重建的研究提供種子細胞。方法：通過采用F8雙腔導尿管導尿術(shù)收集6只成年雄性新西蘭大白兔(體重介于2.0-2.5kg)尿液。采用離心分離法分離尿源性干細胞,經(jīng)貼壁篩選法純化細胞,KSFM和EFM混合培養(yǎng)基外體培養(yǎng)擴增。光鏡下觀察細胞形態(tài)；繪制細胞生長曲線；測定細胞增殖情況；流式細胞術(shù)鑒定細胞免疫表型；并誘導其向尿路上皮細胞和平滑肌細胞分化。結(jié)果：從14份兔子尿液樣本中,成功的分離并培養(yǎng)出尿源性干細胞,每30ml兔子尿液中約有1-2個細胞克隆,在形態(tài)上rUSCs呈“米粒狀”。rUSCs的細胞倍增數(shù)量(PD)和平均倍增時間(DT)分別是48.5±6.2和(25.7±8.4)h；單個rUSC克隆在(51.6士0.5)天內(nèi)可增殖至4×1014個細胞(248.5=3.98×1014)；細胞生長曲線呈正常的細胞增殖模型——“S”型；流式細胞檢測顯示,rUSCs在p3時CD29, CD90和CD105呈陽性表達,而CD31、CD34和CD45表達呈陰性；當誘導表皮生長因子(EGF)加入培養(yǎng)基培養(yǎng),rUSCs可誘導分化為“鵝卵石”樣的細胞,特異性表達上皮細胞蛋白,如AE1/AE3:當誘導平滑肌分化的生長因子TGF-β1和PDGF-BB加入培養(yǎng)基培養(yǎng)時,rUSCs分化為“紡錘狀”樣的細胞,表達平滑肌特異蛋白,如α-SMA、Desmin和Myosin。結(jié)論：根據(jù)課題組初步的實驗數(shù)據(jù)分析顯示,兔尿液中存在USCs,且易于在體外分離和培養(yǎng),并擁具有很強的增殖能力,能夠被誘導分化為尿路上皮細胞和平滑肌細胞。因此,rUSCs在兔子模型中,可以作為一種潛在的自體干細胞來源,用于尿道缺損的重建和膀胱功能的修復。
【關(guān)鍵詞】：干細胞 組織工程 尿液 尿道
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 引言9-10
• 第一章 實驗材料及方法10-25
• 一、兔尿液的收集及尿源性干細胞的分離培養(yǎng)10-12
• 1. 材料10-11
• 2. 實驗方法11-12
• 2.1 尿源性干細胞混合培養(yǎng)基的配制11
• 2.2 兔尿液的收集11-12
• 2.3 兔尿源性干細胞的分離及原代培養(yǎng)12
• 2.4 兔尿源性干細胞的傳代培養(yǎng)12
• 二、兔尿源性干細胞生長曲線及增殖情況的測定12-14
• 1. 材料12-13
• 2. 實驗方法13-14
• 2.1 細胞生長曲線的繪制13
• 2.2 細胞倍增數(shù)及倍增時間13-14
• 三、兔尿源性干細胞表面標志物的流式測定14-15
• 1. 材料14-15
• 2. 實驗方法15
• 2.1 不同含量BSA的配制15
• 2.2 流式細胞測定15
• 四、尿源性干細胞多潛能分化15-18
• 1. 材料15-16
• 2. 實驗方法16-18
• 2.1 兔膀胱平滑肌細胞的原代培養(yǎng)16-17
• 2.2 兔膀胱上皮細胞的原代培養(yǎng)17
• 2.3 兔膀胱平滑肌細胞和上皮細胞的傳代培養(yǎng)17-18
• 2.4 上皮分化誘導培養(yǎng)基的配制18
• 2.5 平滑肌分化誘導培養(yǎng)基的配制18
• 2.6 兔尿源性干細胞的多潛能分化(上皮分化和平滑肌分化)18
• 五、尿源性干細胞誘導分化結(jié)果的鑒定18-25
• 1. 材料18-20
• 2. 實驗方法20-25
• 2.1 細胞爬片前的處理20
• 2.2 細胞爬片20-21
• 2.3 尿源性干細胞誘導分化后細胞的免疫熒光鑒定21-22
• 2.4 Western Blot測定細胞相關(guān)蛋白表達22-25
• 第二章 實驗結(jié)果25-33
• 一、兔尿液的收集及尿源性干細胞的分離培養(yǎng)25-27
• 二、兔尿源性干細胞生長曲線及增殖情況27-29
• 三、表面標志物的流式測定結(jié)果29-30
• 四、兔尿源性干細胞多潛能分化(上皮分化和平滑肌分化)30-31
• 五、兔尿源性干細胞誘導分化細胞的鑒定31-33
• 第三章 討論33-36
• 結(jié)論36
• 參考文獻36-39
• 文獻綜述39-51
• 參考文獻45-51
• 附錄Ⅰ51-52
• 研究生期間科研情況52-53
• 致謝53

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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  本文關(guān)鍵詞：兔尿源性干細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及其生物學特性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：489230