本文關(guān)鍵詞：H2A去泛素化酶MYSM1在血管生成中的作用及其機制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景血管的發(fā)育和生成參與胚胎和個體發(fā)育的各個階段,是多種細(xì)胞和多種分子參與、受多種調(diào)控機制調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。近年來,表觀遺傳調(diào)控在血管發(fā)育和生成中的作用越來越受到重視,已成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點之一。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容,發(fā)生在核小體組蛋白H2A、H2B、H3和H4的N端或C端。常見的組蛋白修飾包括甲基化修飾、乙�；揎�、磷酸化修飾、泛素化修飾和SUMO修飾等,這些修飾對染色質(zhì)的空間構(gòu)象和基因轉(zhuǎn)錄有重要的調(diào)控作用。組蛋白的泛素化修飾主要發(fā)生在H2A和H2B上,H2A泛素化發(fā)生在C端的K119位點,泛素化H2A(ub H2A)占H2A總量的5~15%,是細(xì)胞核內(nèi)泛素化程度最高的蛋白。而H2B泛素化發(fā)生在C端的K120位點,泛素化H2B(ub H2B)占H2B總量的1~2%。H2A的泛素化修飾與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān),而泛素化的H2B則多在轉(zhuǎn)錄激活過程中發(fā)揮作用。除了對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控外,組蛋白泛素化修飾還在細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用。組蛋白泛素化和去泛素化是一個可逆的過程,分別由組蛋白泛素化酶(泛素連接酶)和組蛋白去泛素化酶催化。MYSM1是一種去泛素化酶,其主要功能是去除細(xì)胞核中組蛋白H2A K119位點的泛素化修飾。MYSM1-/-小鼠在造血、免疫系統(tǒng)、皮膚、脂肪組織、視力、骨骼等多系統(tǒng)中存在異常,表明MYSM1功能重要,是不可替代的表觀遺傳學(xué)分子。有關(guān)MYSM1的研究目前主要集中于造血與免疫系統(tǒng),但Huang YC等通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)發(fā)現(xiàn)MYSM1基因的2個單核苷酸的多態(tài)性位點(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)與臺灣人群糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)發(fā)病相關(guān)。由于DR以微血管病變?yōu)橹饕±硖卣?上述研究提示MYSM1可能在血管的發(fā)育和生成過程中扮演重要角色。為探明MYSM1在血管生成中的作用及其機制,本課題檢測了MYSM1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá),利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和MYSM1-/-小鼠在體內(nèi)外驗證了MYSM1在血管生成中的作用,構(gòu)建了內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除MYSM1的Cdh5-Cre~+-MYSM1~(f/f)小鼠并利用芯片初步篩選分析了MYSM1調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能的信號通路和靶基因。上述研究結(jié)果明確了MYSM1對血管生成的促進作用,為深入探索其機制奠定了基礎(chǔ),為系統(tǒng)認(rèn)識血管生成的調(diào)控提供了新線索。目的明確MYSM1在血管生成過程中的調(diào)控作用、初步探索其可能的機制。方法1.通過免疫組化染色、熒光染色、Western-blot以及q RT-PCR檢測MYSM1在血管結(jié)構(gòu)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況以及在低氧和LPS刺激的情況下MYSM1的表達(dá)變化;2.體外HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA下調(diào)MYSM1的表達(dá),通過流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實驗、Transwell實驗、血管形成實驗和血管三維出芽實驗分析MYSM1對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞多種生物學(xué)功能的影響;3.通過小鼠動脈環(huán)出芽實驗以及小鼠視網(wǎng)膜血管的Lectin染色和臟器組織HE染色,檢測MYSM1對血管形成以及功能結(jié)構(gòu)完整性的作用;4.通過Cdh5-Cre小鼠和MYSM1~(f/f)小鼠交配獲得內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除MYSM1的Cdh5-Cre~+-MYSM1~(f/f)小鼠;5.利用基因芯片分析機制研究。結(jié)果1.免疫組化染色結(jié)果顯MYSM1在血管組織中呈現(xiàn)較高表達(dá),細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示MYSM1主要是在HUVEC細(xì)胞核中表達(dá),而在胞漿中幾乎不表達(dá);Western-blot和q RT-PCR實驗顯示HUVEC細(xì)胞中MYSM1的表達(dá)可以被小干擾si MYSM1下調(diào);在低氧和LPS等促血管生成刺激下內(nèi)皮細(xì)胞中MYSM1的表達(dá)升高;2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,下調(diào)HUVEC細(xì)胞中MYSM1的表達(dá),細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡未見明顯的變化;劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示,下調(diào)HUVEC中MYSM1的表達(dá),細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱;血管形成實驗顯示,下調(diào)HUVEC細(xì)胞MYSM1的表達(dá),HUVEC細(xì)胞的血管形成能力降低;三維出芽實驗結(jié)果顯示,下調(diào)MYSM1的表達(dá),HUVEC細(xì)胞的出芽能力降低;3.小鼠動脈環(huán)實驗顯示,C57/B16小鼠動脈環(huán)下調(diào)MYSM1的表達(dá)后出芽能力降低,MYSM1-/-小鼠的動脈環(huán)出芽能力也明顯低于對照組小鼠;小鼠視網(wǎng)膜鋪片實驗結(jié)果顯示,MYSM1-/-小鼠的視網(wǎng)膜血管的密度明顯低于對照組小鼠。臟器組織HE染色發(fā)現(xiàn)MYSM1-/-小鼠血管周圍炎性細(xì)胞聚集;4.已構(gòu)建獲得了內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除MYSM1的Cdh5-Cre~+-MYSM1~(f/f)小鼠;5.芯片結(jié)果分析顯示si RNA敲降MYSM1后,HUVEC細(xì)胞中血管生成相關(guān)信號通路變化明顯,多種調(diào)控血管生成的細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生改變,其中抑血管生成因子Arresten和Canstatin上調(diào)明顯,提示它們可能參與了MYSM1對血管生成的調(diào)控。結(jié)論1.MYSM1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá),且主要表達(dá)于細(xì)胞核;在低氧和LPS等促血管生成刺激時內(nèi)皮細(xì)胞中的MYSM1表達(dá)升高;2.MYSM1對HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡無影響,但能促進HUVEC細(xì)胞的遷移、侵襲、管腔形成和出芽能力;3.MYSM1能促進小鼠動脈環(huán)的出芽能力和視網(wǎng)膜血管的形成并對血管功能結(jié)構(gòu)的完整性具有重要作用;4.構(gòu)建獲得了內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除MYSM1的Cdh5-Cre~+-MYSM1~(f/f)小鼠;5.MYSM1可能通過對抑血管生成因子Arresten和Canstatin的調(diào)控影響血管生成。
【關(guān)鍵詞】：血管生成 表觀遺傳調(diào)控 泛素化修飾 去泛素化酶
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R363
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-24
• 第一部分 MYSM1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)24-37
• 1 實驗材料24-26
• 2 實驗方法26-33
• 3 實驗結(jié)果33-36
• 4 討論36-37
• 第二部分 MYSM1對HUVEC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響37-47
• 1 實驗材料37-38
• 2 實驗方法38-42
• 3 實驗結(jié)果42-46
• 4 討論46-47
• 第三部分 MYSM1對小鼠血管結(jié)構(gòu)和功能的影響47-56
• 1 實驗材料47-48
• 2 實驗方法48-50
• 3 結(jié)果50-54
• 4 討論54-56
• 第四部分 MYSM1促進血管生成的初步機制研究56-60
• 1 實驗材料56
• 2 實驗方法56
• 3 實驗結(jié)果56-58
• 4 討論58-60
• 小結(jié)60-62
• 參考文獻62-70
• 個人簡歷和研究成果70-71
• 致謝71-72

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本文編號：453847