本文關(guān)鍵詞：磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板的研制及HBV抗原特異性T細(xì)胞的初步檢測，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗原特異性T細(xì)胞在機(jī)體抗感染、抗腫瘤以及自身免疫性疾病等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,其數(shù)量的多少和功能的強(qiáng)弱直接反映了人體特異性細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)。所以抗原特異性T淋巴細(xì)胞的動態(tài)監(jiān)測在發(fā)病機(jī)制研究、治療方案選擇和療效觀察以及疫苗效果監(jiān)測等方面都有著重要的參考價值。近20年來,抗原特異性T細(xì)胞的檢測方法有了快速發(fā)展,從最初的Cr5’釋放法、有限稀釋法和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法發(fā)展到了現(xiàn)在的金標(biāo)準(zhǔn)——pMHC多聚體熒光染色及流式分析法,最具特異性和準(zhǔn)確性。但是目前臨床上依然很少對患者進(jìn)行抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能的監(jiān)測,原因是pMHC多聚體價格昂貴,需要流式細(xì)胞儀等特殊儀器；針對各種HLA基因型以及各種病原體抗原、腫瘤抗原或自身抗原的商品化pMHC多聚體非常缺乏,不成系列,難以滿足對各種HLA基因型別的患者以及針對特定病原體的多種抗原表位特異性T細(xì)胞進(jìn)行檢測的實際需要；不能高通量地同步進(jìn)行數(shù)量和功能的分析等。所以進(jìn)一步探索操作簡便、無需特殊儀器、能同步檢測抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能的新方法相當(dāng)重要。本課題組前期以直徑為4.5 μm的磁珠為載體,包被進(jìn)口的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體制備磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞(aAPC-beads),在96孔板中同步檢測OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群中OVA抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和反應(yīng)活性,建立了磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板技術(shù)(aAPC-microplate)并進(jìn)行了方法學(xué)的評價,證明了該技術(shù)在無需特殊儀器條件下的可行性。為了進(jìn)一步實現(xiàn)該技術(shù)的試劑盒化和國產(chǎn)化,本研究首先對pMHC多聚體制備技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),自制H-2Kb/OVA單鏈三聚體(SCT),驗證其構(gòu)象與功能；然后用該蛋白替代進(jìn)口的昂貴商品制備aAPC-beads,建立aAPC-microplate,同步檢測OVA抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量和功能,重新進(jìn)行方法學(xué)論證；最后利用aAPC-microplate技術(shù)初步檢測慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量,主要的結(jié)果如下：1、首次采用重疊延伸PCR和同源重組技術(shù),無需限制性內(nèi)切酶和連接酶,成功構(gòu)建H-2Kb/OVA SCT匡組質(zhì)粒,原核表達(dá)SCT蛋白,鎳柱純化,稀釋復(fù)性折疊,繼而通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)將生物素化的H-2Kb/OVA SCT蛋白包被磁珠,制備成H-2Kb/OVA SCT beads.通過H-2Kb構(gòu)象特異性單抗熒光染色和流式分析驗證了該SCT分子的正確空間構(gòu)象；以該SCT分子為基礎(chǔ)構(gòu)建H-2Kb/OVA四聚體,流式檢測OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群中OVA抗原特異性CD8+T細(xì)胞的比例,與進(jìn)口的H-2Kb-Ig/OVA二聚體檢測結(jié)果相似(38.09% vs.35.32%),提示其與特異性TCR的有效結(jié)合能力。2、利用H-2Kb/OVA SCT beads,在96孔反應(yīng)板中對OVA抗原特異性CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行磁性分選和計數(shù),然后補(bǔ)加ConA培養(yǎng)24h,通過酶聯(lián)斑點實驗檢測OVA抗原特異性CD8+ T細(xì)胞群中分泌IFN-γ的細(xì)胞比例,作為其反應(yīng)活性比。本實驗設(shè)置5個細(xì)胞接種數(shù)量組,每個數(shù)量組設(shè)置3個復(fù)孔,陽性細(xì)胞數(shù)比例由復(fù)孔的平均值表示,并對5個檢測數(shù)量組的平均比例進(jìn)行直線回歸方程校正。方法學(xué)的準(zhǔn)確性分析顯示：aAPC-beads在不同細(xì)胞數(shù)量孔中與靶細(xì)胞的結(jié)合以及在磁場下的分選呈現(xiàn)良好的數(shù)量依賴關(guān)系和線性關(guān)系,R2值均達(dá)0.99以上；特異性分析顯示：aAPC-microplate分選后,陽性細(xì)胞群中OVA抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的比例為92.35%和86.39%(兩次實驗結(jié)果)；重復(fù)性分析顯示：在5個檢測數(shù)量組之間,陽性細(xì)胞比例的平均分析內(nèi)CV值為6.44%和4.01%；對同一份OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群進(jìn)行三次重復(fù)實驗時,分析間CV值為3.22%,符合生物制品鑒定標(biāo)準(zhǔn)；與經(jīng)典的pMHC多聚體流式分析法相比：兩種方法對5只OT-1鼠的檢測結(jié)果經(jīng)配對t檢驗無統(tǒng)計學(xué)差異,p=0.2397,回歸分析顯示兩種檢測方法的吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義,兩組結(jié)果有顯著相關(guān)性,相關(guān)方程為Y=2.229+0.815X,相關(guān)系數(shù)r=0.983,P0.01。反應(yīng)活性檢測結(jié)果顯示：2只OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群經(jīng)aAPC-microplate分選后,OVA抗原特異性CD8+T細(xì)胞群的反應(yīng)活性比分別為43.83%和41.87%。另外,傳統(tǒng)ELISPOT檢測OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群經(jīng)OVA抗原肽刺激后分泌IFN-y的細(xì)胞比例分別為4.44%和4.01%,遠(yuǎn)低于aAPC-microplate方法和經(jīng)典pMHC多聚體流式分析法的檢測比例。3、利用課題組前期自制的HLA-A*0201/HBc18-27、A*0201/HBe183-191、A*0203/HBc18-27、 A*0203/HBe183-191和A*0206/HBc18-27五種單鏈三聚體蛋白,包被磁珠制成五種HLA-A2/HBV beads,利用aAPC-microp late方法對慢性乙肝患者PBMC中HBV抗原特異性CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量檢測。初步結(jié)果有：運用流式分析和PCR-SBT方法對20余名慢性乙肝患者進(jìn)行HLA-A2基因分型,得5例HLA-A2陽性患者。進(jìn)口HLA-A2/HBV二聚體熒光染色和流式分析顯示：HBc18-27和HBe183-191表位特異性CD8+ T細(xì)胞比例分別為0.15%、0.08%、0.25%、0.08%和0.28%:aAPC-microplate檢測的相應(yīng)比例為0.10%、0.11%、0.28%、0.10%和0.23%。配對t檢驗顯示兩組結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異,p=0.9454,相關(guān)方程為Y=0.028+0.811X,相關(guān)系數(shù)r=0.893,P0.01。本研究首先利用新技術(shù)方案自制了H-2Kb/OVA單鏈三聚體蛋白,具有正確構(gòu)象與功能；然后用其替代昂貴的進(jìn)口商品建立aAPC-microplate方法,同步檢測OT-1鼠中OVA抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能,完成了方法學(xué)論證,提示了技術(shù)的可行性；最后利用aAPC-microplale技術(shù)初步檢測慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量,結(jié)果與經(jīng)典的進(jìn)口HLA-A2/HBV多聚體流式分析法無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究為下一步制備臨床試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：抗原特異性T細(xì)胞 磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板 HBV
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 主要英文縮寫詞11-13
• 前言13-16
• 文獻(xiàn)綜述 基于pMHC復(fù)合體的抗原特異性T細(xì)胞檢測技術(shù)的研究進(jìn)展16-30
• 參考文獻(xiàn)25-30
• 第一節(jié) H-2K~b/OVA單鏈三聚體分子的構(gòu)建、表達(dá)與驗證30-47
• 引言30-31
• 1. 材料和試劑31-34
• 2. 方法34-42
• 3. 結(jié)果42-45
• 4. 討論45-47
• 第二節(jié) aAPC-microplate技術(shù)對OVA抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能的同步檢測47-68
• 引言47-48
• 1. 材料和試劑48-49
• 2. 方法49-53
• 3. 結(jié)果53-66
• 4. 討論66-68
• 第三節(jié) aAPC-microplate技術(shù)初步檢測HBV抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量68-80
• 引言68-69
• 1. 材料和試劑69-70
• 2. 方法70-74
• 3. 結(jié)果74-78
• 4. 討論78-80
• 小結(jié)與展望80-81
• 參考文獻(xiàn)81-84
• 致謝84-85
• 作者簡介85

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本文編號：448025