本文關(guān)鍵詞：孕酮對AD細(xì)胞模型及動(dòng)物模型tau蛋白過度磷酸化的影響及機(jī)制探討，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)是阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)的病理核心機(jī)制之一。研究表明,諸多因素都能夠引起tau的異常磷酸化,其中,最具有研究意義的是β-樣淀粉蛋白(Aβ)。研究表明,PI3K/AKt-GSK-3β信號(hào)通路是調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的主要通路之一。孕酮(Progesterone,PROG),在臨床上多被用于治療女性生殖系統(tǒng)的疾病,其實(shí)它也是一種在大腦內(nèi)起關(guān)鍵作用的內(nèi)源性神經(jīng)甾體。研究表明,孕酮可以通過抑制神經(jīng)細(xì)胞興奮性毒性、改善AD動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶功、抑制神經(jīng)元凋亡等方面發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究采用Aβ活性片斷Aβ25-35作用于原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型、以APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動(dòng)物模型,分別研究了孕酮在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平對神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化的影響及相關(guān)機(jī)制。方法:1皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)將新生24 h內(nèi)的SD大鼠,超凈臺(tái)內(nèi)取皮質(zhì)部分,用1.25 g/L胰酶消化;加入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液終止消化,接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,細(xì)胞密度為1.0×109/L,5%CO2和37℃條件下靜置培養(yǎng)。4 h后換為neurobasal完全培養(yǎng)液(100 ml加B27 2 m1),48 h后加入阿糖胞苷(終濃度5μg/ml)阻止膠質(zhì)細(xì)胞共同生存;共培養(yǎng)8~10 d。2凝聚態(tài)Aβ25-35的制備將Aβ25-35凍干粉溶解于無菌雙蒸水配制成終濃度為1 mmol/L的儲(chǔ)備液,混勻、分裝,于37℃無菌環(huán)境放置3 d,使其老化、凝聚。3 d后取出,于-20℃凍存、備用。3實(shí)驗(yàn)分組3.1 Aβ25-35對神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化的影響將神經(jīng)元隨機(jī)分為Control、Aβ25-35(20μM、40μM),共同培養(yǎng)24h。采用western blot法檢測p-tau(Ser404)和p-tau(Thr231)的蛋白表達(dá)。3.2孕酮對Aβ25-35引起的神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化的影響將神經(jīng)元隨機(jī)分為Control、Aβ25-35(20μM)、Aβ25-35+PROG(1μM),共同培養(yǎng)24 h。采用western blot法和免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測p-tau(Ser404)和p-tau(Thr231)的蛋白表達(dá)。3.3孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化的作用及機(jī)制研究將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為兩組:APP/PS1模型組和PROG治療組,每組6只。PROG治療組:于頸部皮下部位給予孕酮,連續(xù)注射5d,休息2 d,繼續(xù)注射,如此循環(huán)一個(gè)月。APP/PS1模型組:注射同等計(jì)量的生理鹽水。采用免疫組織熒光化學(xué)法檢測p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)、p-GSK-3β(Tyr216)和p-AKt(Ser473)的蛋白表達(dá)。3.4孕酮對Aβ25-35引起的神經(jīng)元內(nèi)GSK-3β的影響將神經(jīng)元隨機(jī)分為Control、Aβ25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+Li Cl(5m M,GSK-3β特異性抑制劑),共同培養(yǎng)24 h。采用western blot法檢測p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)和p-GSK-3β(Tyr216)的蛋白表達(dá)。3.5孕酮對Aβ25-35引起的神經(jīng)元內(nèi)PI3K/AKt的影響將神經(jīng)元隨機(jī)分為Control、Aβ25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+PROG+LY294002(10μM,PI3K/AKt特異性抑制劑),共同培養(yǎng)24 h。采用western blot法檢測p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)、p-GSK-3β(Tyr216)和p-AKt(Ser473)的蛋白表達(dá)。3.6 PGRMC1在孕酮抑制tau蛋白過度磷酸化過程中的作用將神經(jīng)元隨機(jī)分為Control、Aβ25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+PROG+AG205(5μM,PROG膜受體抑制劑)、Aβ25-35+PROG+RU486(5μM,PROG核受體抑制劑),共同培養(yǎng)24 h。采用western blot法檢測p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)的蛋白表達(dá)。3.7 PGRMC1對PI3K/AKt-GSK-3β信號(hào)通路的影響將神經(jīng)元隨機(jī)分為Control、Aβ25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+PROG+AG205,共同培養(yǎng)24 h。采用western blot法檢測p-GSK-3β(Tyr216)和p-AKt(Ser473)的蛋白表達(dá)。4 Western Blot法檢測p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)、T-tau、p-GSK-3β(Tyr216)、p-AKt(Ser473)、T-GSK-3β、T-AKt的表達(dá)收集各組細(xì)胞,提取總蛋白,用BCA法定量。以SDS-PAGE電泳分離,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉,加入用脫脂奶粉稀釋的一抗(p-Tau[Ser404],p-Tau[Thr231],T-tau,p-GSK-3β[Tyr216],T-GSK-3β,p-AKt[Ser473],T-AKt,1:1000稀釋),4℃孵育過夜,加入二抗反應(yīng)2 h。顯色、X光片曝光。掃描膠片,應(yīng)用Image J圖像分析軟件對條帶進(jìn)行定量分析。5免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測神經(jīng)元內(nèi)p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)的表達(dá)PBS清洗玻片上的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,0.05%Triton-X100打孔,再用3%的BSA封閉;將細(xì)胞按比例加入一抗:(p-Tau[Ser404],1:200稀釋,p-Tau[Thr231],1:200稀釋),4℃孵育過夜;加入二抗,在37℃黑暗環(huán)境孵育2 h。最后用熒光顯微鏡觀察。6免疫組織熒光化學(xué)檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)p-tau(Ser404)、p-tau(Thr231)、p-GSK-3β(Tyr216)、p-AKt(Ser473)的表達(dá)待小鼠8月齡時(shí),將小鼠麻醉、取腦,置于4%多聚甲醛中固定,備用;將切好的腦片用山羊血清封閉液封閉30 min,按比例加入一抗:(p-Tau[Ser404],p-Tau[Thr231],p-GSK-3β[Tyr216],p-AKt[Ser473],1:200稀釋),4℃孵育過夜;加入二抗,避光孵育2 h,Hoechst33258染色5 min;熒光顯微鏡觀察。7數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果以P0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 Aβ25-35對神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化的影響Western blot結(jié)果顯示:與Control組相比,20、40μM Aβ25-35均能引起大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白表達(dá)水平顯著性升高(P0.05)。T-tau未見顯著性變化。但考慮到Aβ25-35的毒性,故選擇20μM Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)元作為AD細(xì)胞模型。2孕酮對Aβ25-35引起的神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化的影響Western blot結(jié)果顯示:與Aβ25-35損傷組相比,PROG保護(hù)組p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示:與Control組相比,Aβ25-35損傷組神經(jīng)元內(nèi)的p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白在胞漿明顯表達(dá),胞核無著色(P0.05);與Aβ25-35損傷組相比,PROG保護(hù)組p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白著色顯著降低(P0.05)。3孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮層、海馬tau蛋白磷酸化水平的影響免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示:APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)皮層、海馬神經(jīng)元內(nèi)p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白顯著著色;與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠相比,經(jīng)孕酮治療后的小鼠腦區(qū)p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。4孕酮對Aβ25-35引起的神經(jīng)元GSK-3β的影響Western blot結(jié)果顯示:與Aβ25-35損傷組相比,PROG保護(hù)組和Li Cl處理組均能引起p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05),以及p-GSK-3β表達(dá)的顯著降低(P0.05)。5孕酮對Aβ25-35引起的神經(jīng)元PI3K/AKt的影響Western blot結(jié)果顯示:與Control組相比,Aβ25-35損傷組能夠引起p-AKt蛋白表達(dá)顯著性降低(P0.05);與Aβ25-35損傷組相比,PROG保護(hù)組能夠引起p-AKt蛋白表達(dá)顯著性升高(P0.05);與PROG保護(hù)組相比,LY294002處理組p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05)。6 PGRMC1在孕酮抑制tau蛋白過度磷酸化過程中的作用Western blot結(jié)果顯示:與PROG保護(hù)組相比,AG205處理組能夠顯著增加p-tau(Thr231)、p-tau(Ser404)的蛋白表達(dá)(P0.05),而RU486處理組沒有引起tau蛋白磷酸化位點(diǎn)的顯著變化。7 PGRMC1對PI3K/AKt-GSK-3β通路的影響Western blot結(jié)果顯示:與PROG保護(hù)組相比,AG205組能夠顯著增加p-GSK-3β的蛋白表達(dá)(P0.05);同時(shí),AG205組顯著降低了p-AKt的蛋白表達(dá)(P0.05)。8孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)GSK-3β的影響免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示:APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)神經(jīng)元內(nèi)p-GSK-3β顯著著色;與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠相比,經(jīng)孕酮治療后的小鼠腦區(qū)p-GSK-3β的表達(dá)量顯著降低(P0.05)。9孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)PI3K/AKt通路的影響免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示:APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)神經(jīng)元內(nèi)p-AKt著色不明顯;與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠相比,經(jīng)孕酮治療后的小鼠腦區(qū)p-AKt的表達(dá)量顯著升高(P0.05)。結(jié)論:1孕酮能夠抑制Aβ25-35引起的原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元以及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)內(nèi)tau蛋白過度磷酸化。2孕酮對Aβ25-35引起的神經(jīng)元內(nèi)及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)tau蛋白過度磷酸化的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKt-GSK-3β通路完成的。3 PGRMC1可能介導(dǎo)了孕酮抑制神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化以及調(diào)節(jié)PI3K/AKt-GSK-3β通路的作用。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 孕酮 β-淀粉樣蛋白 tau蛋白過度磷酸化 PI3K/AKt-GSK-3β信號(hào)通路 PGRMC1 神經(jīng)保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文縮寫15-16
• 引言16-18
• 第一部分 孕酮對AD細(xì)胞模型及動(dòng)物模型tau蛋白過度磷酸化的影響18-35
• 前言18-19
• 材料與方法19-24
• 結(jié)果24-25
• 附圖25-29
• 附表29-30
• 討論30-31
• 小結(jié)31-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 第二部分 孕酮抑制AD細(xì)胞模型及動(dòng)物模型tau蛋白過度磷酸化的機(jī)制研究35-52
• 前言35-36
• 材料與方法36-39
• 結(jié)果39-40
• 附圖40-46
• 討論46-48
• 小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 結(jié)論52-53
• 綜述 關(guān)于tau蛋白在阿爾茨海默病中的研究現(xiàn)狀53-66
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人簡歷67

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：孕酮對AD細(xì)胞模型及動(dòng)物模型tau蛋白過度磷酸化的影響及機(jī)制探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：446896