本文關鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素阻斷ELISA方法的建立與應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(CP)是一種重要的人獸共患病病原體,廣泛分布于自然界,可導致多種動物發(fā)生壞死性腸炎、腸毒血癥以及人類的氣性壞疽和食物中毒。迄今為止,已研究發(fā)現(xiàn)該菌能產(chǎn)生15種外毒素。NetB毒素是首次在壞死性腸炎(NE)病雞體內(nèi)分離的A型CP中發(fā)現(xiàn)的,NetB毒素在禽類NE的發(fā)病機制中是一種關鍵的致病因子。因此,研究該毒素蛋白的生物學功能及檢測方法對CP的診斷和防治有重要的意義。本文將CP NetB毒素蛋白表達產(chǎn)物經(jīng)切膠純化和復性后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,應用間接ELISA和Western blot方法對所制備的抗體進行檢測。結果顯示多抗血清效價達到1:32768,且重組蛋白與制備的多克隆抗體發(fā)生特異性結合,具有良好的反應原性。將實驗室保存的4株抗NetB毒素雜交瘤細胞株復蘇并進行生物學活性分析,選擇反應性好的單克隆抗體(McAb)F9G3株腹腔接種BALB/c小鼠成功進行了腹水的制備。以純化的CP重組NetB蛋白、兔抗CP NetB蛋白多抗和F9G3 McAb經(jīng)三因素優(yōu)化建立了檢測CP抗體的阻斷ELISA方法。優(yōu)化后結果顯示抗原最佳包被濃度為0.5μg/100μL,包被時間為4℃過夜;最佳封閉液為1%BSA,時間為37℃作用2 h;待檢血清的作用時間為1.5 h;單克隆抗體的最佳工作濃度為0.0625μg/100μL,時間為37℃作用1 h;酶標抗體最佳稀釋度為1:5 000,時間為37℃孵育1 h;最佳顯色液作用時間為10 min。通過對90份CP陰性血清阻斷ELISA檢測結果進行統(tǒng)計學分析,確定本方法的判定標準為當阻斷率PI≥31.88%時為陽性,PI≤22.08%時為陰性,22.08%PI31.88%時為可疑。通過敏感性、特異性和重復性試驗等證明此檢測方法敏感性高、特異性強、可重復性好。通過對免疫雞血清抗體效價消長規(guī)律的檢測證明該方法的可靠性和準確性。利用此方法對342份臨床血清樣品進行檢測,共有12份樣品為CP NetB毒素抗體陽性,說明黑龍江省雞場中存在產(chǎn)生NetB毒素的CP感染。
【關鍵詞】：產(chǎn)氣莢膜梭菌 NetB毒素 多克隆抗體 阻斷ELISA 應用
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 不同類型產(chǎn)氣莢膜梭菌研究進展10-11
• 1.1.1 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌10-11
• 1.1.2 B、C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌11
• 1.1.3 E型產(chǎn)氣莢膜梭菌11
• 1.2 雞壞死性腸炎概述11-14
• 1.2.1 α 毒素與壞死性腸炎12
• 1.2.2 NetB毒素與壞死性腸炎12
• 1.2.3 雞壞死性腸炎流行病學12-13
• 1.2.4 雞壞死性腸炎發(fā)病誘因13
• 1.2.5 雞壞死性腸炎臨床癥狀和病理變化13-14
• 1.2.6 雞壞死性腸炎的防治14
• 1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的診斷技術14-16
• 1.3.1 病原學診斷方法14
• 1.3.2 分子生物學診斷方法14-15
• 1.3.3 血清學診斷方法15-16
• 1.4 研究目的和意義16-17
• 2 材料與方法17-30
• 2.1 試驗材料17-20
• 2.1.1 試驗動物和細胞17
• 2.1.2 菌株、質(zhì)粒及血清17
• 2.1.3 主要分子生物學試劑17
• 2.1.4 主要試劑的配制17-20
• 2.1.5 儀器設備20
• 2.2 試驗方法20-30
• 2.2.1 抗原制備20-23
• 2.2.2 多克隆抗體制備和生物活性鑒定23-24
• 2.2.3 單克隆抗體腹水制備和生物學活性鑒定24-25
• 2.2.4 阻斷ELISA方法的建立25-27
• 2.2.5 阻斷ELISA方法的特異性試驗27-28
• 2.2.6 阻斷ELISA方法的靈敏度試驗28
• 2.2.7 阻斷ELISA方法的重復性試驗28
• 2.2.8 重組NetB蛋白免疫雞血清抗體效價動態(tài)變化檢測28
• 2.2.9 阻斷ELISA方法對臨床樣品的檢測28-29
• 2.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計29-30
• 3 結果30-44
• 3.1 重組NetB蛋白的誘導表達30-31
• 3.2 多克隆抗體的制備及鑒定31-32
• 3.2.1 NetB多克隆抗血清的效價測定31-32
• 3.2.2 多克隆抗體的Western blot檢測32
• 3.3 單克隆抗體腹水的制備和生物學活性鑒定32-34
• 3.3.1 腹水的純化32
• 3.3.2 單克隆抗體濃度和效價的測定32-34
• 3.4 阻斷ELISA方法的建立與應用34-44
• 3.4.1 阻斷ELISA方法的優(yōu)化34-40
• 3.4.2 阻斷ELISA方法的臨界值的確定40
• 3.4.3 阻斷ELISA方法的靈敏性的試驗40
• 3.4.4 阻斷ELISA方法的特異性試驗40-41
• 3.4.5 阻斷ELISA方法的重復性試驗41
• 3.4.6 重組NetB蛋白免疫雞血清抗體效價動態(tài)變化檢測41-42
• 3.4.7 阻斷ELISA方法對臨床樣品的檢測42-44
• 4 討論44-47
• 4.1 腹水的制備與純化44
• 4.2 阻斷ELISA方法的建立44
• 4.3 阻斷ELISA方法條件的優(yōu)化44-45
• 4.4 阻斷ELISA方法特異性試驗45
• 4.5 阻斷ELISA方法的應用45-47
• 5 結論47-48
• 致謝48-49
• 參考文獻49-54
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王海軍;芮藝;鮑萍;;肉雞小腸球蟲病繼發(fā)壞死性腸炎的診治[J];甘肅畜牧獸醫(yī);2009年01期

  本文關鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素阻斷ELISA方法的建立與應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：439884