發(fā)布時(shí)間：2017-06-10 14:15

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌eis基因表達(dá)對(duì)人THP-1細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:結(jié)核菌的持留性和結(jié)核分枝桿菌的耐藥性為目前控制結(jié)核病的兩大難題,結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的持留性,結(jié)核持留菌的存在是結(jié)核病感染呈現(xiàn)慢性化的最主要原因。結(jié)核持留菌在機(jī)體內(nèi)的存在是臨床上診斷和治療結(jié)核病時(shí)結(jié)核菌的潛伏感染、結(jié)核病復(fù)發(fā)、結(jié)核菌耐藥、遷延不愈,結(jié)核病治療期限延長(zhǎng)、預(yù)后不佳等一系列問(wèn)題發(fā)生的原因,持留菌通過(guò)多種渠道和方式從抗結(jié)核藥物的滅菌和機(jī)體的免疫系統(tǒng)殺傷中逃逸出來(lái),保持了結(jié)核分枝桿菌在環(huán)境中的穩(wěn)定性和對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性和無(wú)反應(yīng)性,導(dǎo)致耐藥和持留。至今結(jié)核分枝桿菌的持留的機(jī)制尚未完全明確,持留的途徑尚未完全揭開(kāi),因此臨床上迄今為止并沒(méi)有針對(duì)結(jié)核持留菌進(jìn)行完全有效治療的方法,并進(jìn)一步控制結(jié)核病。而研究發(fā)現(xiàn)MTB能進(jìn)入巨噬細(xì)胞,且被巨噬細(xì)胞吞噬后,由于巨噬細(xì)胞內(nèi)特殊基因的表達(dá),導(dǎo)致了結(jié)核菌對(duì)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng),從而達(dá)到持留作用。結(jié)核分枝桿菌基因組者全序列的闡明基礎(chǔ)研究中為臨床上根除持留菌從基因和分子生物學(xué)的角度為揭開(kāi)結(jié)核桿菌持留生存的機(jī)制提供了理論支持。MTBeis基因僅存在于致病性MTB中,可抑制細(xì)胞保護(hù)性免疫反應(yīng),增加非致病性MTB在宿主細(xì)胞內(nèi)的持留,eis基因產(chǎn)物Eis蛋白為一可溶性分泌蛋白,分子量大致為42kd,能作用于巨噬細(xì)胞,有研究證實(shí)該42kd蛋白能夠影響巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子(tunlornecrosisfactor,tnf)-a和白介素(interlukin,il)-10的分泌,有效的抑制了單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞的活化而與持留的的關(guān)聯(lián)。本課題組之前何師姐的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)結(jié)核分枝桿菌eis基因的產(chǎn)物eis蛋白能夠提升巨噬細(xì)胞吞噬恥垢分枝桿菌之后恥垢桿菌于宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存率,結(jié)核分枝桿菌在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)的比較具體的持留機(jī)制尚不清楚。目前已有文獻(xiàn)指出,機(jī)體細(xì)胞因子表達(dá)和分泌的變化對(duì)機(jī)體的免疫和結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞的持留和潛伏感染都會(huì)產(chǎn)生影響,eis基因可增加結(jié)核菌在巨噬細(xì)胞的持留是否與其可能影響吞噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌和作用有關(guān),目前文獻(xiàn)中報(bào)到的很少。IL-10具有非常廣泛的生物學(xué)的活性,其為一種多功能的機(jī)體負(fù)性免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子,是一種免疫抑制性的細(xì)胞因子,且有高效性。能改變機(jī)體免疫應(yīng)答和mhcⅡ類抗原表達(dá),也可選擇性抑制巨噬細(xì)胞某些方面的功能,也抑制了對(duì)t細(xì)胞和b細(xì)胞的功能。本次實(shí)驗(yàn)的主要目的即使為了要探索eis基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌感染單核巨噬細(xì)胞之后的巨噬細(xì)胞分泌和表達(dá)的各種細(xì)胞因子影響,篩選出具有差異性表達(dá)的細(xì)胞因子,為進(jìn)一步從細(xì)胞免疫入手研究eis基因持留機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.以rpmi1640培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清)培養(yǎng)濃度為1×105的thp-1細(xì)胞,之后pma誘導(dǎo)細(xì)胞使thp-1細(xì)胞分化,將重組結(jié)核分枝桿菌ms-pmv261-eis及對(duì)照菌ms-pmv261培養(yǎng)7天后離心集菌,少量培養(yǎng)基用力吹打、震蕩混合均勻,紫外光分光光度計(jì)計(jì)算細(xì)菌濃度,最后按moi=10:1感染thp-1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞。2.取細(xì)胞上清液,用elisa方法檢測(cè)eis基因?qū)hp-1細(xì)胞中il-10的影響將thp-1細(xì)胞種至6孔板,以pma誘導(dǎo)分化24小時(shí)后以pbs清洗細(xì)胞并以重組分枝桿菌感染細(xì)胞,18h收集細(xì)胞上清液,室溫下1000g離心15min,取100hul以elisa檢測(cè)il-4,il-6,il-10,il-12,inf-γ表達(dá)情況;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和測(cè)得的od值繪制成為標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)描繪的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞因子的濃度。3.收集細(xì)胞提取細(xì)胞總rna,rt-pcr檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步檢測(cè)il-10的濃度,在基因?qū)用娴谋磉_(dá)。18h后收集細(xì)胞,提取總rna,根據(jù)上述elisa檢查結(jié)果設(shè)計(jì)特異性表達(dá)il-10細(xì)胞因子的引物,rt-pcr檢測(cè)進(jìn)一步確證該細(xì)胞因子的基因表達(dá)。引物序列:上游引物:5’-ggcttcctaactgctaca-3’下游引物:5’-ctcctgacctcaagtgat-3;反應(yīng)條件:pcr反應(yīng)條件為:95oc預(yù)變性5min;95oc變性30s,60oc退火30s,72oc延伸30s,共35個(gè)循環(huán)后再72oc延伸10min。pcr擴(kuò)增結(jié)束,pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行收集,后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。4.用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù),spss15.0統(tǒng)計(jì)軟件,以x±s表示,兩組進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果:1.pma成功誘導(dǎo)thp-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞,重組結(jié)核分枝桿菌MS-pmv261-eis及對(duì)照菌MS-pmv261,按MOI=10:1感染Thp-1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞。2.ELISA結(jié)果顯示,結(jié)核分枝桿菌eis基因可引起IL-10 OD值明顯增加(P0.05),而對(duì)細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-12、INF-γ的表達(dá)無(wú)顯著影響(P0.05)3.收集細(xì)胞后提取的巨噬細(xì)胞細(xì)胞RNA,之后進(jìn)行的RT-PCR的檢測(cè),測(cè)定的結(jié)果為IL-10的mRNA條帶的表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論:1.提取細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞上清液,檢測(cè)eis基因?qū)奘杉?xì)胞分泌以及表達(dá)和IL-10等細(xì)胞因子的影響,以ELISA方法。結(jié)果表明eis基因能夠上調(diào)IL-10的表達(dá)(P0.05),而對(duì)IL-4、IL-6、IL-12、INF-γ的表達(dá)無(wú)顯著影響(P0.05)。2.RT-PCR檢測(cè)進(jìn)一步IL-10mRNA條帶增強(qiáng),從基因水平表明eis基因上調(diào)IL-10的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 eis基因 單核巨噬細(xì)胞 白介素-10
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-18
• 參考文獻(xiàn)17-18
• 1 材料與方法18-27
• 2 結(jié)果27-30
• 3 討論30-33
• 4 小結(jié)33-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 文獻(xiàn)綜述：細(xì)胞因子在結(jié)核病中的研究進(jìn)展以及結(jié)核菌的持留機(jī)制36-47
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 致謝47-48
• 讀研期間發(fā)表論文48

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  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌eis基因表達(dá)對(duì)人THP-1細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：438789