本文關(guān)鍵詞：一株1型單純皰疹病毒參考株的建立及特性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus, HSV1)是皰疹病毒科α病毒亞科的一員,能引起多種疾病,包括齦口炎,病毒性腦炎,角膜結(jié)膜炎等,能夠感染多種細(xì)胞并在體內(nèi)感染中建立潛伏感染。針對HSV感染目前還沒有疫苗和完全清除體內(nèi)病毒的藥物被研發(fā)出來。此外,HSV由于其具有大型環(huán)狀DNA和神經(jīng)潛伏感染的特征,在研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)可以作為載體而得到廣泛的應(yīng)用。本研究中從臨床病人口唇部皰液分離得到一株病毒,通過Vero細(xì)胞擴(kuò)增純化,通過PCR分析、電鏡鑒定確定該病毒為1型HSV,命名為HSV1-ZW6,對其進(jìn)行病毒增值特性分析,包括對其感染不同細(xì)胞病變形態(tài)學(xué)分析、一步生長曲線的繪制、小鼠神經(jīng)毒力檢測試驗(yàn)等,結(jié)果提示此分離株與實(shí)驗(yàn)室傳代毒株HSV1-8F相比,其神經(jīng)毒力略高于HSV1-8F。利用高通量測序技術(shù)對此株病毒基因組進(jìn)行了測序,聯(lián)合Sanger測序?qū)ζ溥M(jìn)行修補(bǔ),最終獲得了150290bp的病毒全基因組序列,并通過對全基因進(jìn)行基因預(yù)測和注釋獲得其全基因組結(jié)構(gòu)圖,選取部分基因進(jìn)行親緣關(guān)系進(jìn)化樹繪制和簡單重復(fù)序列分析,發(fā)現(xiàn)位于IRL/TRL區(qū)的一段32個(gè)A/T重復(fù)的特征序列。根據(jù)已知序列,利用CRISPR-Cas9技術(shù)快速獲得了一株帶有綠色熒光蛋白的重組病毒ZW6-EGFP。此外,本研究在建立了二倍體細(xì)胞KMB17細(xì)胞代次與端粒長度變化模型的基礎(chǔ)上,在細(xì)胞水平檢測了單純皰疹病毒感染KMB17細(xì)胞后,對感染后端粒長度的影響,初步發(fā)現(xiàn)HSV1感染KMB17細(xì)胞后會(huì)對其產(chǎn)生影響,而感染癌細(xì)胞或永生化細(xì)胞系則未發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果。通過對HSVl的分離、鑒定及全基因組測序完成,本研究建立了一株新的HSV1參考株及其相應(yīng)的報(bào)告病毒,利用該病毒研究病毒與細(xì)胞之間的相互作用進(jìn)行了初步探索,更多的生物特性還有待進(jìn)一步的深入研究。
【關(guān)鍵詞】：單純皰疹病毒 全基因組 測序 重組病毒 端粒
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-8
• 第一部分 1型單純皰疹病毒的分離鑒定及增殖特性分析8-23
• 1 前言8-10
• 2 實(shí)驗(yàn)材料10-12
• 2.1 細(xì)胞10
• 2.2 引物序列10
• 2.3 試劑及耗材10-11
• 2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物11
• 2.5 儀器設(shè)備11-12
• 3 實(shí)驗(yàn)方法12-16
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)12
• 3.2 病毒分離12-13
• 3.3 病毒蝕斑純化13
• 3.4 病毒PCR鑒定13-15
• 3.5 病毒的電鏡觀察15
• 3.6 病毒滴度測定15
• 3.7 病毒在不同細(xì)胞增殖特性15
• 3.8 病毒生長曲線測定15
• 3.9 動(dòng)物神經(jīng)毒力實(shí)驗(yàn)15-16
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-21
• 4.1 病毒的噬斑純化16
• 4.2 病毒PCR檢測16-17
• 4.3 病毒電鏡結(jié)果17-18
• 4.4 病毒在不同細(xì)胞病變情況18-19
• 4.5 病毒感染不同細(xì)胞生長曲線測定19-20
• 4.6 動(dòng)物神經(jīng)毒力實(shí)驗(yàn)20-21
• 5 實(shí)驗(yàn)討論21-23
• 第二部分 低代次1型皰疹病毒全基因組測序及初步分析23-51
• 1 前言23-25
• 2 實(shí)驗(yàn)材料25-30
• 2.1 病毒株和細(xì)胞25
• 2.2 引物序列25-29
• 2.3 主要參考序列29-30
• 2.4 序列分析軟件及在線分析系統(tǒng)30
• 3 實(shí)驗(yàn)方法30-34
• 3.1 病毒全基因組提取30
• 3.2 基因組限制性片段長度多態(tài)性分析30-31
• 3.3 病毒全基因組的二代測序31
• 3.4 病毒全基因組的修補(bǔ)31-33
• 3.5 病毒全基因組序列的組裝及提交33
• 3.6 病毒全基因組分析33-34
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-46
• 4.1 病毒基因組提取及限制性片段長度多態(tài)性分析34-35
• 4.2 基因組Illumina測序結(jié)果35
• 4.3 基因組的PCR缺口修補(bǔ)35-37
• 4.4 病毒基因組基因預(yù)測37
• 4.5 病毒基因組結(jié)構(gòu)37-39
• 4.6 病毒的點(diǎn)陣分析39
• 4.7 進(jìn)化樹的構(gòu)建39-42
• 4.8 病毒基因組簡單重復(fù)序列分析42-46
• 5 實(shí)驗(yàn)討論46-51
• 第三部分 基于CRISPR-Cas9技術(shù)的重組單純皰疹病毒的構(gòu)建51-57
• 1 前言51-52
• 2 實(shí)驗(yàn)材料52
• 2.1 病毒株及細(xì)胞52
• 2.2 質(zhì)粒52
• 2.3 引物序列52
• 3 實(shí)驗(yàn)方法52-53
• 3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染52
• 3.2 病毒感染52
• 3.3 病毒的噬斑純化52-53
• 3.4 PCR檢測病毒TK基因53
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-55
• 4.1 Cas9誘導(dǎo)病毒基因組同源重組53-54
• 4.2 重組病毒的噬斑純化及TK基因檢測54-55
• 5 實(shí)驗(yàn)討論55-57
• 第四部分 HSV1與端粒長度變化的細(xì)胞模型建立的初步研究57-65
• 1 前言57-58
• 2 實(shí)驗(yàn)材料58
• 2.1 病毒株和細(xì)胞58
• 2.2 引物序列58
• 3 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 3.1 病毒感染58
• 3.2 病毒感染后細(xì)胞端粒長度測定58-59
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-63
• 4.1 端粒長度PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳59-60
• 4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制60-61
• 4.3 KMB17隨傳代次數(shù)增加端�？s短61
• 4.4 病毒感染對細(xì)胞端粒影響61-63
• 5 實(shí)驗(yàn)討論63-65
• 實(shí)驗(yàn)小結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 附錄Ⅰ HSV1-ZW6全基因組序列編碼基因列表71-77
• 附錄Ⅱ 重組熒光病毒測序77-78
• 附錄Ⅲ 英文縮寫詞表78-79
• 附錄Ⅳ 主要溶液及培養(yǎng)基配制79-82
• 致謝82-83
• 研究生簡歷83-84

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 游志勇;;對病毒的再認(rèn)識[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué);1988年01期

2 ;病毒“抱團(tuán)”侵襲機(jī)體效率高[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2010年03期

3 丁鏟;;病毒的進(jìn)化與傳播[J];中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào);2010年04期

4 顧葆良;;病毒基因及其應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);1981年02期

5 馬亞敏;;病毒基因能夠保護(hù)植物免遭病害[J];生物技術(shù)通報(bào);1986年05期

6 Andrew Scott;史久華;;改善病毒的印象[J];世界科學(xué);1989年09期

7 向近敏;;關(guān)于病毒生態(tài)的幾個(gè)問題[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;1990年01期

8 石無魚;;病毒是我們的“助產(chǎn)婆”[J];大科技(科學(xué)之謎);2011年04期

9 紀(jì)昕,翁梁,曹淑桂,馮雁;非病毒基因治療的研究進(jìn)展[J];生物學(xué)雜志;2002年02期

10 劉銘;;病毒幫助人類進(jìn)化[J];環(huán)境;2002年04期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁鏟;;病毒的進(jìn)化與傳播[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第二次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 紀(jì)昕;翁梁;曹淑桂;馮雁;;非病毒基因治療的研究進(jìn)展[A];“加入WTO和科學(xué)技術(shù)與吉林經(jīng)濟(jì)發(fā)展——機(jī)遇·挑戰(zhàn)·責(zé)任”吉林省第二屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下）[C];2002年

3 陳柳;云濤;余斌;倪征;華炯鋼;李雙茂;;禽病毒免疫逃避的機(jī)制[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

4 李洋;金寧一;韓松;魯會(huì)軍;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十二次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

5 吳建國;;病毒與致病、致癌因子的相互作用及功能研究[A];湖北省生物工程學(xué)會(huì)2004年年會(huì)學(xué)術(shù)報(bào)告及論文摘要匯編[C];2004年

6 黃娟;姜平;張常印;唐泰山;李永東;張治濤;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立[A];第六屆全國會(huì)員代表大學(xué)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上）[C];2005年

7 黃娟;姜平;張常印;唐泰山;李永東;張治濤;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

8 張航;劉梁;孟祥高;劉長林;;多苯并咪唑金屬配合物—一類新型非病毒基因釋放的載體[A];第六屆全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

9 李俊;王金寶;張禎濤;周順;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)分子生物學(xué)研究進(jìn)展[A];山東畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)豬專業(yè)委員會(huì)第一屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

10 萬遂如;;當(dāng)前我國豬群中新出現(xiàn)的病毒感染[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十二次人獸共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第六屆第十四次教學(xué)專業(yè)委員會(huì)論文集[C];2012年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報(bào)記者 張夢然;病毒預(yù)警 未雨綢繆[N];科技日報(bào);2010年

2 肖園;病毒與人體的較量 是殺死還是共存？[N];北京科技報(bào);2012年

3 胡軒逸;病毒，與生命如影隨形[N];光明日報(bào);2014年

4 張?zhí)锟?病毒可能幫助人類進(jìn)化[N];健康報(bào);2001年

5 曉 陽;高科技驗(yàn)血病毒旋即現(xiàn)形[N];大眾科技報(bào);2004年

6 林子;人類與病毒之戰(zhàn)永無寧日？[N];中國商報(bào);2003年

7 奇云;如果沒有病毒 世界會(huì)怎樣[N];大眾科技報(bào);2003年

8 本報(bào)記者 王丹 譚嘉;病毒跨種傳播研究需要“剝洋蔥”[N];健康報(bào);2013年

9 李文;病毒致癌機(jī)制研究最新進(jìn)展[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

10 記者 劉海英;病毒會(huì)利用微RNA對人體實(shí)施攻擊[N];科技日報(bào);2010年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李麗薇;細(xì)胞miRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）復(fù)制的相關(guān)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 繆佶;禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒轉(zhuǎn)錄組學(xué)及免疫抑制機(jī)理的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

3 王賽賽;基于DIP病毒的腫瘤相關(guān)γ皰疹病毒—宿主拮抗機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2016年

4 李偉陽;肝癌與宮頸癌中病毒整合研究[D];華南理工大學(xué);2016年

5 劉長龍;豬繁殖與呼吸綜合征病毒3’非編碼區(qū)對病毒復(fù)制調(diào)控作用解析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

6 高飛;豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非編碼區(qū)順式作用元件的解析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

7 譚菲菲;豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白在病毒復(fù)制過程中的作用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

8 賀云霞;應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2006年

9 陸嘉琦;豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非翻譯區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能解析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

10 張福明;網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增技術(shù)檢測EB病毒基因的方法建立及臨床應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2004年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 霍鵬;利用多重?zé)晒舛縋CR鑒定番木瓜病毒及番木瓜eIF4E家族基因干擾效應(yīng)研究[D];海南大學(xué);2015年

2 白云;豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5a功能的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 朱克森;鴨坦布蘇病毒的分離、鑒定[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 呂曉玲;miR-21a-5p對PHEV復(fù)制的影響及其作用機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2016年

5 劉歡;常見蔬菜病毒病病原鑒定及多重RT-PCR的建立與應(yīng)用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

6 陳晨;一株1型單純皰疹病毒參考株的建立及特性分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

7 韋瑩;PRRSV nsp2氨基酸缺失對病毒在細(xì)胞中復(fù)制和炎癥因子應(yīng)答的影響[D];廣西大學(xué);2016年

8 朱攀;昆明市小兒腹瀉相關(guān)病毒的分子流行病學(xué)研究及病毒基因組克隆[D];昆明理工大學(xué);2013年

9 陳弘;上海、山西地區(qū)HIV-1分離株vif基因序列分析[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

10 顏丕熙;鴨坦布蘇病毒分離鑒定及其生物學(xué)特性的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

  本文關(guān)鍵詞：一株1型單純皰疹病毒參考株的建立及特性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：438651