本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲高遷移率族蛋白活化小鼠巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血吸蟲病廣泛流行于非洲、亞洲和南美,是僅次于瘧疾的一種寄生蟲病。血吸蟲病的長期防控依賴于高效疫苗的應(yīng)用。目前國際上公認(rèn)的具有較高保護(hù)力效果的疫苗是輻照致弱的尾蚴/童蟲疫苗(RAV),但由于材料來源困難、安全性等問題,不能大規(guī)模使用。因此,需要通過研究RAV模型的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制來研發(fā)出高效、安全的抗血吸蟲分子疫苗。研究發(fā)現(xiàn)RAV模型可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高水平的以Th1為優(yōu)勢應(yīng)答的高保護(hù)力,其原因可能是輻照后蟲體損傷嚴(yán)重,移行緩慢,長期滯留在肺部并伴隨大量蟲源性分子的釋放,引起宿主較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。高遷移率族蛋白(HMGB1)是一種核蛋白,在電離輻射條件下可從核內(nèi)遷移至胞外。已有研究表明曼氏血吸蟲HMGB1可誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞釋放大量的致炎細(xì)胞因子,是引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子。因此推測日本血吸蟲HMGB1(SjHMGB1)作為蟲源性的應(yīng)激分子在RAV誘導(dǎo)的高保護(hù)力中發(fā)揮了類似的重要作用。本研究旨在探索SjHMGB1在活化宿主免疫細(xì)胞,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)上的功能。為進(jìn)一步闡明SjHMGB1在RAV中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。1、分析SjHMGB1在輻照與正常蟲體細(xì)胞上的表達(dá)情況。體外培養(yǎng)不同期別的輻照和正常童蟲,用胰酶消化成單個細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示SjHMGB1在輻照早期4 d時的表達(dá)量明顯高于正常組,7 d時顯著下降低于正常組(P0.01),10 d、14 d兩者無顯著差異;RT-PCR檢測SjHMGB1的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)輻照組在4 d、7 d顯著高于正常組(P0.01),在10 d時兩組無顯著差異。初步推斷SjHMGB1在輻照童蟲早期大量表達(dá)釋放。2、分析reSjHMGB1誘導(dǎo)致敏小鼠淋巴細(xì)胞的反應(yīng)。reSjHMGB1蛋白刺激致敏小鼠淋巴細(xì)胞48h后,MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群狀況以及胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示該蛋白能夠顯著的刺激致敏小鼠淋巴細(xì)胞增殖(SI2);蛋白免疫組CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值為2.28顯著高于對照組的1.76(P0.01),且胞內(nèi)IFN-?的表達(dá)量顯著增加(P0.01)。提示SjHMGB1蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。3、分析reSjHMGB1在調(diào)節(jié)宿主固有免疫中的作用。reSjHMGB1與RAW264.7細(xì)胞共孵育48 h,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子、ELISA檢測胞外細(xì)胞因子。結(jié)果表明reSjHMGB1刺激組與對照組相比,RAW264.7細(xì)胞表面Toll受體4(TLR4)受體上調(diào)表達(dá),差異極顯著(P0.01),而Toll受體2(TLR2)受體下調(diào)表達(dá)(P0.05),同時胞外TNF-α和NO的分泌量顯著增加(P0.01)。提示SjHMGB1可通過TLR4通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向致炎性的M1型巨噬細(xì)胞分化。4、研究reSjHMGB1誘導(dǎo)宿主樹突狀細(xì)胞(DC)功能成熟。reSjHMGB1刺激分選后的DC 48 h后再與CD4+T細(xì)胞共孵育168 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面分子、胞內(nèi)細(xì)胞因子和T細(xì)胞增殖情況,ELISA檢測胞外細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果表明reSjHMGB1刺激組DC細(xì)胞表面的趨化因子受體CCR7和CXCR4顯著上調(diào)表達(dá)(P0.01),同時胞外TNF-α,IFN-?,IL-4的含量顯著增加(P0.01)。reSjHMGB1蛋白與DC和CD4+T共孵育實驗結(jié)果表明,CD4+T釋放IFN-?顯著增加(P0.01)。提示SjHMGB1促進(jìn)DC功能成熟,活化CD4+T細(xì)胞,誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。5、初步探索reSjHMGB1活化嗜中性粒細(xì)胞的功能。蛋白刺激嗜中性粒細(xì)胞4 h后,通過顯微鏡觀察嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)的形成,RT-PCR檢測細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。實驗結(jié)果表明蛋白刺激后可觀察到明顯的NETs現(xiàn)象,且與對照組相比MMP-9,MCP-1,CCL-3和CXCL-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高(P0.01)。提示SjHMGB1能夠刺激嗜中性粒細(xì)胞向炎癥表型分化。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)SjHMGB1在輻照童蟲早期大量表達(dá)及釋放,能夠活化巨噬細(xì)胞、促進(jìn)DC功能成熟、活化CD4+T細(xì)胞并誘導(dǎo)其向Th1型分化。初步探索了SjHMGB1刺激嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成的過程。為進(jìn)一步闡明SjHMGB1在RAV模型中所發(fā)揮的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 高遷移率族蛋白B1 巨噬細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R383.24
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 緒論13-23
• 1.1 血吸蟲生物學(xué)概述13-15
• 1.1.1 血吸蟲及其生活史13-14
• 1.1.2 血吸蟲的流行病學(xué)特點14
• 1.1.3 血吸蟲的致病機(jī)理14-15
• 1.2 血吸蟲疫苗研究概況15-16
• 1.3 輻照致弱血吸蟲疫苗的研究進(jìn)展16-17
• 1.4 HMGB1分子的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能17-20
• 1.4.1 HMGB1分子的結(jié)構(gòu)17-18
• 1.4.2 HMGB1分子的生物學(xué)功能18-20
• 1.4.3 血吸蟲HMGB1的研究20
• 1.5 固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答20-23
• 1.5.1 固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的區(qū)別與聯(lián)系20-22
• 1.5.2 血吸蟲抗原誘導(dǎo)Mφ極化及活化DC的功能與機(jī)制22-23
• 第二章 SjHMGB1在輻照與正常日本血吸蟲童蟲細(xì)胞上的表達(dá)分析23-33
• 2.1 實驗材料23-24
• 2.1.1 尾蚴23
• 2.1.2 實驗動物23
• 2.1.3 主要試劑和儀器23-24
• 2.1.4 溶液配制24
• 2.2 實驗方法24-28
• 2.2.1 收集體外培養(yǎng)不同期別輻照與正常日本血吸蟲童蟲24-25
• 2.2.2 RT-PCR檢測SjHMGB1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平25-27
• 2.2.3 SjHMGB1在輻照和正常蟲體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)研究27-28
• 2.3 實驗結(jié)果28-31
• 2.3.1 不同期別蟲體SjHMGB1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較28-29
• 2.3.2 SjHMGB1多克隆抗體特異性分析29-30
• 2.3.3 SjHMGB1在輻照和正常蟲體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)研究30-31
• 2.4 討論31-33
• 第三章 SjHMGB1誘導(dǎo)致敏小鼠淋巴細(xì)胞反應(yīng)的研究33-41
• 3.1 實驗材料33-34
• 3.1.1 實驗動物33
• 3.1.2 實驗細(xì)胞33
• 3.1.3 主要試劑和儀器33-34
• 3.2 實驗方法34-37
• 3.2.1 免疫小鼠34
• 3.2.2 真核蛋白的制備34
• 3.2.3 MTT法檢測混合淋巴細(xì)胞增殖34-35
• 3.2.4 致敏小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群的測定35
• 3.2.5 混合淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測35-36
• 3.2.6 混合淋巴細(xì)胞胞外細(xì)胞因子檢測36-37
• 3.3 實驗結(jié)果37-40
• 3.3.1 脾臟混合淋巴細(xì)胞的增殖情況37
• 3.3.2 淋巴細(xì)胞亞群的測定37-38
• 3.3.3 混合淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測38-39
• 3.3.4 混合淋巴細(xì)胞胞外細(xì)胞因子檢測39-40
• 3.4 討論40-41
• 第四章 SjHMGB1活化巨噬細(xì)胞的功能分析41-52
• 4.1 實驗材料41-42
• 4.1.1 實驗細(xì)胞41
• 4.1.2 主要試劑和儀器41-42
• 4.2 實驗方法42-44
• 4.2.1 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)42
• 4.2.2 SjHMGB1蛋白刺激巨噬細(xì)胞增殖現(xiàn)象42
• 4.2.3 SjHMGB1蛋白刺激巨噬細(xì)胞分泌到上清中NO水平42-43
• 4.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子43
• 4.2.5 RT-PCR檢測細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平43-44
• 4.2.6 ELISA檢測胞外細(xì)胞因子44
• 4.3 實驗結(jié)果44-50
• 4.3.1 SjHMGB1蛋白刺激巨噬細(xì)胞增殖現(xiàn)象44-45
• 4.3.2 SjHMGB1蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO45-46
• 4.3.3 SjHMGB1上調(diào)巨噬細(xì)胞表面受體分子以及MHC-Ⅱ分子的表達(dá)46-48
• 4.3.4 RT-PCR檢測細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平48-49
• 4.3.5 ELISA檢測胞外細(xì)胞因子49-50
• 4.4 討論50-52
• 第五章 SjHMGB1促進(jìn)DC功能成熟的鑒定52-64
• 5.1 實驗材料52-53
• 5.1.1 實驗動物52
• 5.1.2 主要試劑和儀器52-53
• 5.1.3 溶液配制53
• 5.2 實驗方法53-58
• 5.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測BMDC表面受體53-55
• 5.2.2 RT-PCR檢測細(xì)胞因子與趨化因子受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平55-56
• 5.2.3 ELISA檢測SjHMGB1刺激BMDC胞外細(xì)胞因子56
• 5.2.4 CFSE檢測CD4+T細(xì)胞增殖56-58
• 5.2.5 ELISA檢測CD4+T細(xì)胞胞外細(xì)胞因子58
• 5.3 實驗結(jié)果58-62
• 5.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測SjHMGB1刺激BMDC表面受體表達(dá)情況58-59
• 5.3.2 RT-PCR檢測趨化因子受體與細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平59-60
• 5.3.3 ELISA檢測SjHMGB1刺激BMDC胞外細(xì)胞因子水平60
• 5.3.4 CFSE法檢測CD4+T細(xì)胞增殖60-61
• 5.3.5 ELISA檢測CD4+T細(xì)胞胞外細(xì)胞因子61-62
• 5.4 討論62-64
• 第六章 SjHMGB1誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱的形成64-73
• 6.1 實驗材料64-65
• 6.1.1 尾蚴64
• 6.1.2 實驗動物64-65
• 6.1.3 主要試劑和儀器65
• 6.2 實驗方法65-68
• 6.2.1 Western Blot檢測嗜中性粒細(xì)胞胞內(nèi)histone3的含量65-66
• 6.2.2 RT-PCR檢測細(xì)胞因子與趨化因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平66-67
• 6.2.3 日本血吸蟲蟲卵及可溶性蟲卵蛋白（SEA）的制備67-68
• 6.2.4 嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）現(xiàn)象68
• 6.3 實驗結(jié)果68-72
• 6.3.1 Western Blot檢測嗜中性粒細(xì)胞胞內(nèi)histone3的含量68-69
• 6.3.2 嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞因子與趨化因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平69-70
• 6.3.3 嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）現(xiàn)象70-72
• 6.4 討論72-73
• 第七章 全文總結(jié)73-74
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果80-81
• 1.發(fā)表論文80
• 2.作者簡介80-81
• 致謝81

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