本文關(guān)鍵詞：廣譜病毒感染抑制劑的篩選及其作用機制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,諸如SARS、MERS、禽流感和埃博拉等新發(fā)突發(fā)傳染病疫情的暴發(fā)日趨頻繁,人類面臨病毒性傳染病的現(xiàn)實和潛在威脅日益嚴(yán)峻,人類應(yīng)對突發(fā)傳染病的防控壓力日感倍增,但愈來愈多的實際情況表明:當(dāng)病毒發(fā)生突變或出現(xiàn)新型病毒而導(dǎo)致傳染病疫情暴發(fā)時,原來的特異性防治藥物難以發(fā)揮應(yīng)有防控效果,甚至毫無療效,而人類認(rèn)知水平和科研周期的限制,又使具有顯著療效的新一代特異性預(yù)防和治療藥物難以在短時間內(nèi)推出,極易導(dǎo)致疫情的迅速擴散和局部地區(qū)的災(zāi)難性暴發(fā),不僅對當(dāng)?shù)氐墓残l(wèi)生服務(wù)造成極大的破壞,同時也對社會的政治和經(jīng)濟造成巨大的沖擊。因此,依據(jù)病毒的基本生物學(xué)特性,針對病毒侵染宿主細(xì)胞的共性靶點,研發(fā)新型廣譜性長效病毒感染抑制劑,對于應(yīng)對病毒性傳染病疫情的持續(xù)挑戰(zhàn)具有重要意義。植物化合物被稱為“第七類營養(yǎng)素”,廣泛存在于日常食物,是一類對人體健康具有特殊作用的非營養(yǎng)性化學(xué)物質(zhì)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物活性,并逐漸成為抗病毒研究的熱點之一,如表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate,EGCG),單寧酸(Tannins),黃芪多糖(Astragalus Polysacharin,APS)等。初步的研究結(jié)果顯示:植物化合物的生物學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)在其對細(xì)胞膜生物學(xué)特性的影響和局部微環(huán)境平衡的改變等方面,部分植物化合物通過直接嵌入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu),改變細(xì)胞膜正常的功能性流動,進(jìn)而發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)。病毒是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生生物,只有順利穿過宿主細(xì)胞膜并成功進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒,才能完成其感染增殖周期,因此,細(xì)胞膜是絕大多數(shù)病毒必須突破的第一道宿主防御屏障,是其啟動成功感染的“必經(jīng)之路”,也是各種病毒必須克服的共性障礙。從宿主細(xì)胞的角度來講,病毒對細(xì)胞膜的侵入是一個病理性的過程,必然會導(dǎo)致宿主細(xì)胞膜生理特性的一些變化,如細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的流動性或細(xì)胞膜電勢電位的改變。針對此類植物化合物抑制病毒感染機制的研究,多數(shù)集中于干擾某一種病毒的特異性感染靶點的描述,而有關(guān)其廣譜性抑制病毒感染機理的探索相對較少,尤其是關(guān)于在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中,植物化合物對細(xì)胞膜的生物學(xué)效應(yīng)是否能夠拮抗或干擾病毒對宿主細(xì)胞膜的病理性影響,進(jìn)而導(dǎo)致病毒的胞膜侵染和胞飲內(nèi)吞功能障礙等方面的研究,國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本研究分別以流感病毒和腺病毒的細(xì)胞感染模型為基礎(chǔ),通過對表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG),單寧酸(Tannins),黃芪多糖(APS)等三種植物化合物抑制病毒感染效果的初步評價,分析此三種植物化合物在不同條件下抑制病毒感染的特點和效力,分別利用熒光偏振技術(shù)和熒光標(biāo)記膜電位檢測技術(shù),比較不同條件下,植物化合物和病毒對細(xì)胞膜流動性和膜電位的影響以及相關(guān)的變化規(guī)律,期望對植物化合物廣譜性抑制病毒感染的機制開展一些初步的探索,并為研制廣譜性的病毒感染抑制劑提供技術(shù)支持,切實提高整體應(yīng)對病毒性傳染病的預(yù)防能力和控制水平。一、EGCG、單寧酸和黃芪多糖體外抑制病毒感染效果的分析利用5型腺病毒細(xì)胞感染模型和甲型H1N1流感病毒細(xì)胞感染模型,通過中性紅吞噬技術(shù),分別開展EGCG、單寧酸和黃芪多糖等三種植物化合物對293A細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的毒性分析研究,結(jié)果顯示:1、EGCG、單寧酸和黃芪多糖對293A細(xì)胞的最大無毒性濃度(TC0)分別為640μg/ml、1280μg/ml和1280μg/ml,對照樣品利巴韋林的TC0為640μg/ml。2、EGCG、單寧酸和黃芪多糖對MDCK細(xì)胞的最大無毒性濃度(TC0)分別為1280μg/ml、640μg/ml和1280μg/ml,對照樣品利巴韋林的TC0為640μg/ml。顯然,所篩選的三種植物化合物的細(xì)胞毒性均不高于已經(jīng)獲得安全許可的對照樣品利巴韋林。為進(jìn)一步明確此三種植物化合物體外抑制病毒感染的效果,分別利用感染劑量均為100TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒,依次在病毒感染前、感染同時和感染后三種條件下,分別添加三種植物化合物,通過觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE),分析此三種植物化合物抑制CPE的有效濃度,結(jié)果顯示:1、感染腺病毒時,EGCG在上述三種條件下的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為162±11μg/ml、607±29μg/ml和325±26μg/ml;單寧酸的IC50分別為303±47μg/ml、197±19μg/ml和400±40μg/ml;而黃芪多糖僅在病毒吸附前加入時具有一定的抑制作用,IC50為449±50μg/ml;對照樣品利巴韋林的IC50分別為604±25μg/ml、561±52μg/ml和177±27μg/ml。2、感染甲型H1N1病毒時,EGCG在上述三種條件下的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為465±15μg/ml、543±37μg/ml和519±55μg/ml;在病毒吸附前和吸附同時添加單寧酸時,均可檢測到明顯的抑制作用,IC50分別為411±54μg/ml和234±36μg/ml;但沒有檢測到黃芪多糖抑制CPE效果,而對照樣品利巴韋林僅在病毒吸附后添加時,具有抑制細(xì)胞病變的效果,IC50為330±24μg/ml。很顯然,在細(xì)胞水平的安全使用濃度下,病毒感染前,首先添加EGCG溫育60分鐘預(yù)處理細(xì)胞,與病毒吸附的同時添加單寧酸溫育60分鐘,EGCG和單寧酸均具有顯著的抑制細(xì)胞病變的作用,顯示其擁有良好的預(yù)防性抑制腺病毒和流感病毒感染的應(yīng)用價值。二、EGCG、單寧酸和黃芪多糖抑制病毒感染機制的初步研究甲型H1N1流感病毒是有囊膜的分節(jié)段RNA病毒,而腺病毒是無囊膜的雙鏈DNA病毒,2種病毒的外形結(jié)構(gòu)和蛋白組成差別巨大,同時其在細(xì)胞內(nèi)的增殖策略也完全不同,但2者均須克服具有相同結(jié)構(gòu)和功能特點細(xì)胞膜屏障,才能完成其有效感染和復(fù)制增殖過程,因此,宿主細(xì)胞膜應(yīng)是EGCG、單寧酸和黃芪多糖等植物化合物發(fā)揮其廣譜性干擾病毒侵染作用的理想靶標(biāo)之一。為深入探索此類植物化合物的作用機制,本研究針對病毒侵染時所引起的細(xì)胞膜病理性改變,EGCG、單寧酸和黃芪多糖存在時對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的影響,以及此類植物化合物的生物學(xué)效應(yīng)對病毒感染的干擾/拮抗作用等一系列數(shù)據(jù)和指標(biāo),開展了相關(guān)的檢測和比較分析。1、通過細(xì)胞膜電位特異性熒光探針Di BAC4(3)的標(biāo)記,利用流式細(xì)胞熒光檢測技術(shù),分析細(xì)胞膜電位變化的特點,結(jié)果顯示:宿主細(xì)胞分別被感染滴度為100 TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒后,其細(xì)胞膜電位均呈下降趨勢,細(xì)胞膜的去極化率分別升高38.12%與83.91%。三種植物化合物存在時對細(xì)胞的膜電位均有不同程度的影響,尤其是EGCG,可使293A細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的膜電位顯著升高,在640μg/ml的有效濃度下,可使293A細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的膜電位去極化率分別降低29.38%和43.76㳠。在EGCG存在的條件下,可明顯降低因病毒感染所導(dǎo)致的細(xì)胞膜電位升高的現(xiàn)象。尤其是在5型腺病毒感染前使用10μg/ml-640μg/ml濃度的EGCG干擾病毒感染時,宿主細(xì)胞膜去極化率降低1.31㳠-31.86㳠。Spearman雙變量等級相關(guān)分析也表明,只有在5型腺病毒感染前,使用EGCG預(yù)處理293A細(xì)胞,其對宿主細(xì)胞膜電位的干預(yù)作用與其抑制病毒感染作用具有相關(guān)性(R=0.931,p0.05)。2、通過DPH(1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene)熒光探針的標(biāo)記,利用熒光偏振技術(shù),檢測細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的熒光各向異性(r)的變化特點(注:細(xì)胞膜熒光各向異性r與細(xì)胞膜流動性成反比),結(jié)果顯示:宿主細(xì)胞分別被感染滴度為100 TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒后,其細(xì)胞膜流動性顯著升高,敏感細(xì)胞的膜熒光各向異性分別降低了13.57㳠和15.76㳠。EGCG、單寧酸和黃芪多糖均可使293A和MDCK細(xì)胞的膜流動性不同程度的降低,在640μg/ml濃度下,此三種物質(zhì)可使293A細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高32.61㳠、25.75㳠和5.22㳠;使MDCK細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高36.56㳠、74.60㳠和3.37㳠。在病毒感染前、感染同時和感染后三種條件下,分別添加濃度為640μg/ml的三種植物化合物后,均能不同程度的降低因病毒感染而導(dǎo)致的宿主細(xì)胞膜流動性升高的病理性變化,添加單寧酸時,293A細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高5.68㳠、5.08㳠和21.17㳠,MDCK細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高78.45㳠、75.50㳠和70.92㳠;添加EGCG時,可使293A細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高19.71㳠、2.26㳠和15.56㳠;于病毒感染前和感染后添加EGCG時,可使MDCK細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高32.69㳠和34.82㳠;于病毒感染前添加黃芪多糖時,可使293A細(xì)胞膜熒光各向異性升高4.33㳠,于病毒感染前和病毒感染同時添加時,可使MDCK細(xì)胞膜熒光各向異性升高1.00㳠和7.12㳠。Spearman雙變量等級相關(guān)分析結(jié)果也表明,EGCG和單寧酸在三種條件下,其對宿主細(xì)胞膜流動性的生物學(xué)效應(yīng)與其抑制病毒感染的作用有明顯的相關(guān)性。EGCG,單寧酸具有顯著降低細(xì)胞膜流動性的生物學(xué)效應(yīng),此種效應(yīng)可有效的拮抗因病毒感染而引起的細(xì)胞膜流動性升高的病理性變化,而這種拮抗效果與其抑制多種病毒感染的作用密切相關(guān),顯示此類植物化合物對宿主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的功能性影響,是其具有廣譜性抑制病毒感染的重要機制之一。而對于宿主細(xì)胞膜電位的影響,是否是其具有廣譜性抑制病毒感染機制之一,還需要進(jìn)一步的研究。綜上所述,在安全的使用濃度下,預(yù)防性先期使用EGCG和單寧酸等植物化合物,可以有效的抑制5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒的感染,具有進(jìn)一步研發(fā)為廣譜性病毒感染抑制劑的巨大潛力,而深入研究此類植物化合物的細(xì)胞膜生物學(xué)效應(yīng),為探索其廣譜性抑制病毒感染的機制奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：植物化合物 抑制病毒感染 細(xì)胞膜電位 細(xì)胞膜流動性
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 縮略語13-14
• 前言14-16
• 1篩選廣譜病毒抑制物質(zhì)的意義14
• 2廣譜抑制病毒物質(zhì)研究現(xiàn)狀14
• 3強化宿主防御能力與抑制病毒感染的關(guān)系14-15
• 4本研究的內(nèi)容與目的15-16
• 實驗研究16-46
• 第一部分EGCG、單寧酸和黃芪多糖體外抑制病毒感染效果的分析16-26
• 1 前言16
• 2 材料16-17
• 3 方法17-20
• 4 結(jié)果20-25
• 5 小結(jié)25-26
• 第二部分EGCG、單寧酸和黃芪多糖抑制病毒感染機制的初步研究26-46
• 一病毒感染對宿主細(xì)胞膜電位的影響與EGCG、單寧酸和黃芪多糖的干預(yù)作用26-34
• 1前言26
• 2材料26-27
• 3方法27-29
• 4結(jié)果29-33
• 5小結(jié)33-34
• 二病毒感染對宿主細(xì)胞膜流動性的影響與EGCG、單寧酸和黃芪多糖的干預(yù)作用34-46
• 1前言34
• 2材料34-35
• 3方法35-37
• 4結(jié)果37-44
• 5小結(jié)44-46
• 討論46-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 綜述 廣譜病毒抑制物的研究與應(yīng)用52-59
• 參考文獻(xiàn)57-59
• 植物多酚對5型腺病毒感染后宿主細(xì)胞膜流動性的影響59-70
• 個人簡歷70
• 發(fā)表論文70-71
• 致謝71

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