Fcα/μR是一種近年發(fā)現(xiàn)的能夠與IgA、IgM結(jié)合的Fc受體,基因表達譜廣泛,在小鼠多種臟器組織中均檢測到其mRNA的表達。小鼠Fcα/μR(mFcα/μR)可以介導(dǎo)B細胞對免疫復(fù)合物的內(nèi)吞,但是有關(guān)Fcα/μR生物學功能的更多研究尚在進行中。pIgR也是一種IgA、IgM受體,擔負著將pIgA轉(zhuǎn)運至粘膜細胞表面的重要使命,是機體粘膜免疫的重要分子。由于Fcα/μR與pIgR在染色體的基因定位相鄰,且二者序列蛋白序列同源性較高,加之在與IgA、IgM結(jié)合功能方面具有相似性,因此,本論文將mFcα/μR與mpIgR進行了對比分析,以期為mFcα/μR的功能研究提供更有力的證據(jù)。 首先,本論文的研究從抗體的制備著手。通過原核表達的方法得到了mFcα/μR及mpIgR重要結(jié)構(gòu)域蛋白,并以純化過的表達蛋白為抗原免疫大鼠,制備了大鼠抗mFcα/μR及mpIgR單克隆、多克隆抗體。經(jīng)過ELISA、Western blot、FACS及細胞免疫化學等方法的多次鑒定,挑選出了可以特異識別mFcα/μR及mpIgR的單克隆抗體,確定了多克隆抗體的抗原識別特異性。 為了探討mFcα/μR的組...

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學位級別】：博士

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目錄
摘要
Abstract
英文縮略語對照表
第一章 前言
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 工具酶、限制性內(nèi)切酶、分子量標準及試劑盒
        2.1.2 菌株與細胞株
        2.1.3 PCR擴增用引物
        2.1.4 主要試劑及抗體
        2.1.5 cDNA及質(zhì)粒載體
        2.1.6 實驗動物
        2.1.7 主要儀器設(shè)備
        2.1.8 常用分析軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 目的蛋白的原核表達
            2.2.1.1 組織或細胞總RNA的提取
            2.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            2.2.1.3 PCR反應(yīng)
            2.2.1.4 瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.1.5 瓊脂糖凝膠分離DNA片段的回收
            2.2.1.6 E.coli感受態(tài)細胞的制備
            2.2.1.7 質(zhì)粒的小量提取
            2.2.1.8 DNA分子的酶切與連接
            2.2.1.9 DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
            2.2.1.10 PCR鑒定重組菌落——菌落PCR(Colony PCR)
            2.2.1.11 菌種的保藏
            2.2.1.12 目的蛋白的小量誘導(dǎo)表達
            2.2.1.13 目的蛋白的大量誘導(dǎo)表達
            2.2.1.14 包涵體的純化
            2.2.1.15 His-tag蛋白的鎳柱純化
            2.2.1.16 蛋白質(zhì)濃度測定
            2.2.1.17 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
            2.2.1.18 Semi-dry Western blot(蛋白印跡)
            2.2.1.19 目的蛋白與Sepharose 4B的交聯(lián)
        2.2.2 單克隆抗體的制備及應(yīng)用
            2.2.2.1 動物的免疫
            2.2.2.2 骨髓瘤細胞的培養(yǎng)
            2.2.2.3 收集脾細胞
            2.2.2.4 飼養(yǎng)細胞的制備
            2.2.2.5 細胞融合
            2.2.2.6 挑克隆
            2.2.2.7 陽性克隆的篩選
            2.2.2.8 陽性細胞亞克隆及鑒定
            2.2.2.9 陽性細胞的大量培養(yǎng)及凍存
            2.2.2.10 單克隆抗體獲得及純化
            2.2.2.11 FITC標記蛋白質(zhì)
            2.2.2.12 FACS法檢測抗體與細胞膜表面受體的結(jié)合情況
            2.2.2.13 免疫共沉淀法檢測抗體與細胞中未知蛋白的結(jié)合情況
        2.2.3 免疫組織(細胞)化學
            2.2.3.1 石蠟切片的免疫組織化學
            2.2.3.2 冰凍切片的免疫組織化學
        2.2.4 免疫細胞化學
            2.2.4.1 蓋玻片的處理:
            2.2.4.2 細胞在蓋玻片上的生長:
            2.2.4.3 細胞染色前洗滌及固定
            2.2.4.4 細胞免疫化學染色步驟
        2.2.5 真核細胞轉(zhuǎn)染
第三章 實驗結(jié)果
    3.1 小鼠Fcα/μR的組織及細胞學定位
        3.1.1 大鼠抗小鼠Fcα/μR單克隆及多克隆抗體的制備及鑒定
            3.1.1.1 小鼠Fcα/μR(mFcα/μR)的原核表達
            3.1.1.2 大鼠抗mFcα/μR單克隆抗體的制備及鑒定
            3.1.1.3 大鼠抗mFcα/μR多克隆抗體的鑒定
        3.1.2 大鼠抗小鼠pIgR單克隆抗體的制備及鑒定
            3.1.2.1 小鼠pIgR(mpIgR)的結(jié)構(gòu)特點
            3.1.2.2 mpIgR的原核表達
            3.1.2.3 大鼠抗mpIgR單克隆抗體的制備及鑒定
        3.1.3 小鼠Fcα/μR及pIgR的組織定位研究
            3.1.3.1 mFcα/μR及mpIgR的基因表達譜研究
            3.1.3.2 mFcα/μR及mpIgR在各臟器的免疫組織化學研究
        3.1.4 小鼠Fcα/μR及pIgR在小鼠B淋巴瘤細胞系T560的表達
            3.1.4.1 mFcα/μR在T560的基因表達
            3.1.4.2 mFcα/μR及mpIgR在T560的蛋白表達
    3.2 大鼠Fcα/μR的組織定位初步研究
        3.2.1 大鼠Fcα/μR在各臟器的基因表達
        3.2.2 大鼠Fcα/μR蛋白表達的免疫組織化學研究
            3.2.2.1 小鼠抗rFcα/μR單克隆抗體的篩選
            3.2.2.2 rFcα/μR的免疫組織化學研究
第四章 討論
    4.1 對抗Fcα/μR單克隆和多克隆抗體的評價
    4.2 對抗mpIgR單克隆抗體的評價
    4.3 Fcα/μR和pIgR組織定位分析
        4.3.1 基因表達譜分析
            4.3.1.1 小鼠Fcα/μR和pIgR的基因表達譜分析
            4.3.1.2 大鼠Fcα/μR及其他IgA受體的基因表達譜分析
        4.3.2 蛋白表達的組織定位分析
            4.3.2.1 小鼠Fcα/μR及pIgR在小鼠各臟器中的蛋白表達分析
            4.3.2.2 大鼠Fcα/μR在大鼠各臟器中的蛋白表達分析
    4.4 小鼠Fcα/μR及pIgR在小鼠B淋巴瘤細胞系T560的表達
綜述:pIgR——粘膜免疫中的"Mr.Key"
參考文獻
附錄Ⅰ:質(zhì)粒載體圖譜和多克隆位點
附錄Ⅱ:攻讀博士學位期間文章發(fā)表情況
致謝



本文編號：4012265