目的應(yīng)用熒光劑DAPI探索一種直接定量大腸桿菌O157:H7無(wú)機(jī)多聚磷酸鹽(polyP)的可靠方法。方法提取并純化大腸桿菌O157:H7野生株DNA,DAPI與DNA、polyP45結(jié)合,測(cè)定360 nm和415 nm激發(fā)光的發(fā)射光譜;應(yīng)用共聚焦顯微鏡,觀察細(xì)菌DAPI-DNA和DAPI-polyP復(fù)合物熒光,驗(yàn)證DAPI檢測(cè)polyP的可行性;細(xì)菌液氮速凍溶解、-80℃速凍溶解、-20℃速凍溶解、60℃加熱10 min、Triton x-100作用、室溫下放置后倍比稀釋涂平板,觀察6種方法對(duì)細(xì)菌存活的影響;與DAPI作用后,測(cè)定熒光值,確定細(xì)胞膜通透性的最佳前處理方法;建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),測(cè)定EHEC野生株、ppk1兩個(gè)突變株polyP含量。結(jié)果應(yīng)用360 nm激發(fā)波長(zhǎng),DAPI-DNA最大發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm;應(yīng)用415 nm激發(fā)波長(zhǎng),DAPI-polyP最大發(fā)射波長(zhǎng)為550 nm;應(yīng)用405 nm激發(fā)光,收集DAPI-DNA藍(lán)色熒光(425～475 nm),應(yīng)用488 nm激發(fā)光,收集DAPI-polyP綠色熒光(500～560 nm);最佳細(xì)菌前處理方法為-80℃速凍后室溫下自然溶...

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 菌株和試劑
    1.2 方法
        1.2.1 DAPI-DNA與DAPI-polyP復(fù)合物發(fā)射光譜的掃描
        1.2.2細(xì)菌前處理
        1.2.3 EHEC O157:H7 WT株polyP的共聚焦定性觀察及發(fā)射光譜掃描
        1.2.4 polyP含量的直接測(cè)定
        1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
2 結(jié)果
    2.1 測(cè)定出DAPI-DNA與DAPI-polyP不同的最大發(fā)射波長(zhǎng)
    2.2 比較發(fā)現(xiàn)-80℃速凍室溫下自然溶解是最佳細(xì)菌前處理方法
    2.3 細(xì)胞內(nèi)polyP的定性觀察
    2.4 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
    2.5 各株菌polyP含量測(cè)定
3 討論



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