本實(shí)驗(yàn)的目的旨在克隆、表達(dá)可將外源蛋白或寡核苷酸等基因治療物質(zhì)帶入細(xì)胞質(zhì)、進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核的載體蛋白(Carrier)。在此我們克隆表達(dá)了兩個(gè)載體，先是利用能夠穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域TAT，并在TAT后面連上來(lái)自猿猴病毒大T抗原的核定位信號(hào)（nuclear localization signal, NLS），然后在TAT-NLS序列的后面接上報(bào)告基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）。最后獲得一個(gè)含有TAT-NLS-eGFP基因的pET-22b(+)質(zhì)粒，即pET-TAT-NLS-eGFP，以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并誘導(dǎo)表達(dá)TAT-NLS-eGFP蛋白。探討體外克隆、表達(dá)、純化融合蛋白TAT-NLS-eGFP的可行性，并對(duì)融合蛋白的功能進(jìn)行初步鑒定。其次將編碼人高遷移組蛋白2（human high mobility group protein 2 , HMGN2, 以前稱(chēng)HMG-17）N-末端一個(gè)片段的序列（F3序列）連上報(bào)告基因eGFP，同樣獲得一個(gè)含有F3-eGFP基因的pET-22b(+)質(zhì)粒...

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)說(shuō)明
中文摘要
英文摘要
材料與方法
    1 材料
        1.1 TAT-NLS序列、F3序列及引物合成序列與測(cè)序
            1.1.1 TAT-NLS序列
            1.1.2 F3序列
            1.1.3 擴(kuò)增eGFP的引物
        1.2 細(xì)胞株、菌株、質(zhì)粒
        1.3 分子生物學(xué)工具酶
        1.4 細(xì)胞培養(yǎng)用品
        1.5 蛋白質(zhì)純化材料
        1.6 蛋白質(zhì)羅丹明標(biāo)記
        1.7 其他常規(guī)試劑、無(wú)機(jī)鹽
        1.8 常用緩沖液及細(xì)菌培養(yǎng)基LB
        1.9 實(shí)驗(yàn)儀器
    2 方法
        2.1 各合成片段的連接
        2.2 PCR擴(kuò)增eGFP基因
        2.3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建
            2.3.1 含TAT-NLS質(zhì)粒pET-TAT-NLS的構(gòu)建
            2.3.2 含F(xiàn)3質(zhì)粒pET-F3的構(gòu)建
            2.3.3 原核表達(dá)載體pET-TAT-NLS-eGFP、pET-F3-eGFP和pET-eGFP的構(gòu)建
        2.4 重組融合蛋白及eGFP蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.5 目的蛋白在細(xì)菌細(xì)胞中位置的鑒定
        2.6 可溶表達(dá)上清的制備
        2.7 目的蛋白的純化
        2.8 融合蛋白的濃縮
        2.9 羅丹明標(biāo)記蛋白質(zhì)
        2.10 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
        2.11 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.12 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)融合蛋白的準(zhǔn)備
        2.13 融合蛋白對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)
            2.13.1 融合蛋白TAT-NLS-eGFP在體外對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)
            2.13.2 融合蛋白F3-eGFP在體外對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)
結(jié)果
    1 非病毒載體融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP的克隆、表達(dá)與純化
        1.1 融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP的克隆
            1.1.1 質(zhì)粒pET-TAT-NLS的構(gòu)建
            1.1.2 PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因eGFP
            1.1.3 表達(dá)載體pET-TAT-NLS-eGFP的構(gòu)建
            1.1.4 表達(dá)載體pET-TAT-NLS-eGFP的測(cè)序鑒定
        1.2 融合蛋白TAT-NLS-eGFP的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
    2 非病毒載體融合蛋白基因F3-eGFP的克隆、表達(dá)與純化
        2.1 融合蛋白基因F3-eGFP的克隆
            2.1.1 質(zhì)粒pET-F3的構(gòu)建
            2.1.2 表達(dá)載體pET-F3-eGFP的構(gòu)建
            2.1.3 表達(dá)載體pET-F3-eGFP的測(cè)序鑒定
            2.1.4 融合蛋白F3-eGFP的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
    3 非病毒載體融合蛋白對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
        3.1 融合蛋白TAT-NLS-eGFP的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
        3.2 融合蛋白F3-eGFP的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
        3.3 羅丹明標(biāo)記的融合蛋白F3-eGFP的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
討論
    1 非病毒載體融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP/F3-eGFP的克隆、表達(dá)與純化
    2 融合蛋白TAT-NLS-eGFP和F3-eGFP可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞
參考文獻(xiàn)
綜述
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄



本文編號(hào)：3934824