探索以基因治療為主要手段的抗HBV感染治療的研究是研究熱點之一。目前應(yīng)用于HBV感染基因治療方案主要有DNA疫苗、核酶、反義核酸、干擾肽及干擾蛋白、Dominant negative突變體(DN突變體)、RNAi等，體外或體內(nèi)模型上均顯示出有效性。但由于病毒變異，上述方法需要不斷重復(fù)給藥，載體的安全性、特異性、高效性和可控性等問題，上述療法臨床應(yīng)用還有相當一段距離。本研究擬構(gòu)建一個具有生命體特征的HBV缺陷病毒，以其干擾和抑制HBV的體內(nèi)復(fù)制狀況，并通過調(diào)節(jié)機體對二種病毒的免疫反應(yīng)，阻斷HBV在體內(nèi)的復(fù)制以達到抗HBV感染的目的。 所要構(gòu)建的HBV缺陷病毒的特征是：其包膜和核衣殼與HBV完全相同，基因組結(jié)構(gòu)中缺失HBV基因組的S基因和Pol基因，保留HBV基因組復(fù)制和包裝所需的DR1、DR2、C基因和HBV 3’末端序列，并在缺失的部位引入人免疫調(diào)節(jié)基因表達盒和增強基因組復(fù)制的肝特異性增強子序列。 具體實施過程為：制備高表達HBV S基因和Pol基因的包裝細胞，為乙肝缺陷病毒的制備作準備；構(gòu)建含乙肝缺陷病毒基因組的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和含乙肝病毒基因組的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1·10HBvro盯pMsev(neo)的醉譜分析

的EcoRI和Hpal位點中，構(gòu)成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體HBVpo崢MsCVneo。以pMSCVne�？蛰d體為對照，快篩選取2個重組子質(zhì)粒，分別用EcoRI、HPal、Ec0R1/HPal作酶切鑒定，見圖1一9。選一個酶切鑒定正確的重組子用EcoRI/Hpal、xhol、BglIx、....

圖I一12HBVS基因表達的Western4Blot分析

1圖I一12HBVS基因表達的Western4Blot分析1:未轉(zhuǎn)染細胞對照2:HBVS/pLHCX和HavPox/pMsevneo共轉(zhuǎn)染后G418與3:HBVS/pLHCX轉(zhuǎn)染后G418篩選的抗性細胞4:pLHCX空載體轉(zhuǎn)染細胞VPol全長27O0bp，占HBv基因組的84%。....

圖2一4HBvzpMsCvneo的酶切篩m:DL2000DNAMarker;

I和Hpal位點中，構(gòu)成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體HBV/PMSCVneo。以pMSCVneo空載體為對照，快篩選取2個重組子質(zhì)粒，分別用EcoRFHpal作酶切鑒定，見圖2一4。圖2一4HBvzpMsCvneo的酶切篩選m:DL2000DNAMarker;1:digestedwithE....

圖2一移碼突變處的序列分析

司進行測序，測序結(jié)果用DNAsTAR軟件分析。測序結(jié)果分析在455bP處出現(xiàn)移碼突變(tttttt~橄tttt)，與正確序列相比多了一個t，移碼突變處的序列分析見圖2一5。圖2一移碼突變處的序列分析

本文編號：3934812