目的:獲得抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF165)單克隆抗體,并對(duì)其功能進(jìn)行初步驗(yàn)證。方法:利用噬菌體抗體庫(kù)展示技術(shù)篩選與VEGF165結(jié)合的噬菌體克隆并測(cè)序,以測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增抗體的輕重鏈可變區(qū)基因,并克隆至哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中,構(gòu)建全抗體表達(dá)載體;將全抗體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞,收取培養(yǎng)細(xì)胞上清,利用Protein A親和純化抗體;通過(guò)結(jié)合ELISA、表面等離子共振檢測(cè)抗體的親和力,以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為模型驗(yàn)證抗體功能。結(jié)果:經(jīng)過(guò)噬菌體抗體庫(kù)展示技術(shù)篩出1個(gè)與VEGF165特異性結(jié)合的抗體序列VG2;293E細(xì)胞表達(dá)了VG2全抗體蛋白,SDS-PAGE顯示VG2抗體純度較高;BIAcore檢測(cè)結(jié)果表明該抗體具有較高親和力(KD=0.56 nmol/L),競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA結(jié)果表明VG2抗體能抑制VEGF與VEGF受體(VEGFR)的結(jié)合(IC50為1.470μg/mL),進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VG2能夠抑制VEGF引起的HUVEC增殖。結(jié)論:制備了靶向VEGF165的全人源單克隆抗體VG2,該抗體具有較高的親和力,能阻斷VEGF165/VEG...

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圖1ELISA檢測(cè)噬菌體-抗體結(jié)合曲線5

圖3SDS-PAGE鑒定VG2抗體M：Beyotime彩色預(yù)染蛋白質(zhì)marker（P0068）；1：還原電泳；2：非還原電泳

（圖6）。2.7HUVEC增殖抑制檢測(cè)VG2抗體的功能HUVEC主要用于研究血管生成相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)。VEGF165作用于HUVEC，可引起該細(xì)胞的增殖，因此可以利用該模型評(píng)價(jià)VG2抗體的功能。將HUVEC接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，過(guò)夜培養(yǎng)，向細(xì)胞中加入不同濃度的VG2抗體與VEGF165....

圖4ELISA檢測(cè)全抗體結(jié)合曲線

圖5競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)全抗體結(jié)合曲線

sm繪制抗原抗體結(jié)合曲線（圖4），VG2抗體與VEGF165抗原結(jié)合的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）為6.455ng/mL。2.5競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)VG2抗體的功能ELISA檢測(cè)VG2阻斷VEGF165與VEGFR結(jié)合的能力。將VG2抗體進(jìn)行1/3梯度稀釋，然后與VEGFR混合，將混合....

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