EF4是一個由lepA基因編碼的與蛋白質(zhì)翻譯密切相關(guān)的延伸因子,在細(xì)菌中高度保守,但其確切功能和分子機(jī)制尚不清楚,在結(jié)核分枝桿菌中的功能至今未見報道。為探索EF4在結(jié)核分枝桿菌中的功能,需構(gòu)建一株結(jié)核分枝桿菌lepA基因敲除株。本研究以結(jié)核分枝桿菌H37Ra全基因組DNA為模板,設(shè)計并通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增lepA基因左、右臂,連接到p0004S質(zhì)粒,構(gòu)建同源重組質(zhì)粒p0004S-ΔlepA。然后,通過噬菌體體外包裝,將p0004S-ΔlepA質(zhì)粒連接到phAE159質(zhì)粒,構(gòu)建phAE159-ΔlepA噬菌體包裝質(zhì)粒。在恥垢分枝桿菌mc²155中大量擴(kuò)增噬菌體并受結(jié)核分枝桿菌侵染進(jìn)行同源重組,篩選陽性克隆,從基因組和蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測該突變株中l(wèi)epA基因及EF4蛋白表達(dá)。PCR結(jié)果顯示,敲除株基因組中l(wèi)epA基因已被潮霉素抗性基因成功替換,蛋白免疫印跡結(jié)果顯示該敲除株中無EF4表達(dá),表明其為成功構(gòu)建的RaΔlepA。生長曲線分析顯示,正常培養(yǎng)條件下,結(jié)核分枝桿菌野生株與敲除株生長趨勢一致。敲除株與野生株...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.1.2 試劑和培養(yǎng)基
    1.2 方法
        1.2.1 p0004S-ΔlepA質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.2.2 phAE159-ΔlepA穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.2.3 噬菌體擴(kuò)增
        1.2.4 lepA基因敲除菌株的構(gòu)建
        1.2.5 lepA基因敲除菌株的驗證
        1.2.6 菌落形態(tài)及生長曲線
        1.2.7 細(xì)菌生物膜
        1.2.8 脅迫實驗
2 結(jié)果
    2.1 p0004S-ΔlepA質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.2 phAE159-ΔlepA穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.3 噬菌體擴(kuò)增
    2.4 lepA基因敲除菌株的構(gòu)建
    2.5 野生株和敲除株的菌落形態(tài)及生長曲線分析
    2.6 野生株和敲除株生物膜形成能力的分析
    2.7 野生株和敲除株耐脅迫能力的分析
3 討論



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