人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrom, AIDS)的病原。目前，艾滋病的流行已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康和發(fā)展，從歷史經(jīng)驗(yàn)和長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，發(fā)展安全、有效的疫苗是預(yù)防和控制艾滋病的根本途徑和有效措施之一。 考慮到安全性，用于臨床試驗(yàn)的疫苗株都要求不帶篩選標(biāo)記。活載體疫苗能夠以天然的方式加工和合成抗原并呈遞給免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。密碼子優(yōu)化可以明顯提高抗原的表達(dá)量及DNA疫苗免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。以痘苗病毒為載體的活載體疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)并取得一定效果。本研究的目的是基于我國(guó)HIV-1主要流行株B’／C重組株CN54，構(gòu)建兩株不帶篩選標(biāo)記的多價(jià)重組痘苗病毒疫苗株，并與相應(yīng)的DNA疫苗聯(lián)合免疫BALB／c小鼠，從而探討其誘發(fā)的HIV特異性免疫應(yīng)答。同時(shí)設(shè)立平行實(shí)驗(yàn)組，比較HIV密碼子優(yōu)化的合成基因野生型基因誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答之間是否存在差異，為我國(guó)艾滋病疫苗的臨床試驗(yàn)提供參考。 本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了含有neo基因和lacZ基因雙重...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
前言
    1. HIV簡(jiǎn)介
        1.1 HIV的發(fā)現(xiàn)及分類學(xué)地位
        1.2 HIV的基因組結(jié)構(gòu)
        1.3 HIV的生物學(xué)特征
    2. HIV疫苗研究中的動(dòng)物模型
    3. HIV感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答
    4. HIV感染的體液免疫應(yīng)答
    5. 艾滋病疫苗的研究策略
        5.1 傳統(tǒng)的艾滋病疫苗研究策略
        5.2 新型艾滋病疫苗研究策略
            5.2.1 DNA疫苗的研究進(jìn)展
            5.2.2 活載體疫苗的研究進(jìn)展
    6. 免疫治療
    7. 臨床試驗(yàn)
    8. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>材料和方法
    1. 材料
        1.1 工具酶
        1.2 試劑盒
        1.3 質(zhì)粒和菌株
        1.4 細(xì)胞和毒株
        1.5 抗體和多肽
        1.6 主要生化試劑
        1.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.8 主要儀器
        1.9 常用溶液配方
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pVI75的構(gòu)建
            2.1.1 重組質(zhì)粒pJSD-neo的構(gòu)建
            2.1.2 lacZ'-PH6-neo-polyA片段的獲得
            2.1.3 大片段lacZ'-PH6-neo-polyA克隆及測(cè)序
            2.1.4 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pVI75的構(gòu)建
        2.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pVI75-gagpol的構(gòu)建
        2.3 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pVI75-syngpnef-syngp120的構(gòu)建
            2.3.1 重組質(zhì)粒pVI75-syngp120的構(gòu)建
            2.3.2 PCR擴(kuò)增含有啟動(dòng)子pE／L的目的片段pE／L-syngp120
            2.3.3 片段pE／L-gp120克隆及測(cè)序
            2.3.4 重組質(zhì)粒pVI75-syngpnef-syngp120的構(gòu)建
        2.4 重組痘苗病毒疫苗株rVV-gagpol的構(gòu)建、篩選及純化
            2.4.1 重組質(zhì)粒pVI75-gagpol與痘苗病毒天壇株共轉(zhuǎn)染雞胚細(xì)胞
            2.4.2 重組痘苗病毒的篩選
            2.4.3 重組痘苗病毒rVV-gagpol的鑒定
        2.5 重組痘苗病毒疫苗株rVV-syngpnef-syngp120的構(gòu)建、篩選及純化
            2.5.1 重組質(zhì)粒pVI75-syngpnef-syngp120與痘苗病毒天壇株共轉(zhuǎn)染雞胚細(xì)胞
            2.5.2 重組痘苗病毒的篩選
            2.5.3 重組痘苗病毒rVV-syngpnef-syngp120的鑒定
        2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
            2.6.1 免疫原的制備
            2.6.2 免疫劑量和途徑
            2.6.3 免疫方案及程序
            2.6.4 結(jié)合抗體的檢測(cè)
            2.6.5 小鼠血清中Gag特異性IgG亞類抗體IgG2a和IgG1的檢測(cè)
            2.6.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫反應(yīng)水平
結(jié)果與分析
    1. 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pVI75的構(gòu)建
        1.1 質(zhì)粒pJSD-neo的酶切分析
        1.2 片段lacZ'-PH6-neo-polyA的獲得
            1.2.1 PCR擴(kuò)增片段PH6-neo-polyA
            1.2.2 PCR擴(kuò)增lacZ'
            1.2.3 PCR擴(kuò)增片段lacZ'-PH6-neo-polyA
        1.3 將片段lacZ'-PH6-neo-polyA連接到T載體并進(jìn)行測(cè)序分析
        1.4 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pVI75的酶切鑒定
    2. 重組質(zhì)粒pVI75-gagpol的鑒定
    3. 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pVI75-syngpnef-syngp120的構(gòu)建
        3.1 重組質(zhì)粒pVI75-syngp120的構(gòu)建
        3.2 PCR擴(kuò)增含有啟動(dòng)子pE／L的目的片段pE／L-syngp120
        3.3 質(zhì)粒pT-pE／L-syngp120的鑒定及測(cè)序分析
        3.4 重組質(zhì)粒pVI75-syngpnef-syngp120的酶切鑒定
    4. 重組痘苗病毒rVV-gagpol的構(gòu)建
        4.1 重組痘苗病毒目的基因gagpol的PCR鑒定
        4.2 抗體染色法篩選重組痘苗病毒
        4.3 Western blot檢測(cè)重組痘苗病毒rVV-gagpol中目的基因的表達(dá)
        4.4 痘苗病毒rVV-gagpol的Dot blot鑒定
    5. 重組痘苗病毒rVV-syngpnef-syngp120的構(gòu)建
        5.1 重組痘苗病毒rVV-syngpnef-syngp120目的基因的PCR鑒定
        5.2 Western blot檢測(cè)重組痘苗病毒表達(dá)的Syngpnef和Syngp120蛋白
        5.3 重組痘苗病毒rVV-syngpnef-syngp120的Dot blot鑒定
        5.4 重組痘苗病毒的純化鑒定
    6. 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.1 血清Gag特異性結(jié)合抗體IgG水平的檢測(cè)
        6.2 血清Gag特異性IgG2a、IgG1亞類抗體水平的檢測(cè)
        6.3 血清Env特異性結(jié)合抗體IgG水平的檢測(cè)
        6.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫反應(yīng)水平
討論
    1. 重組痘苗病毒疫苗株篩選平臺(tái)的建立
    2. 抗原的選擇
    3. 表達(dá)HIV多價(jià)重組痘苗病毒疫苗株的篩選和鑒定
    4. 免疫效果的研究
        4.1 gagpol組和syngpnef組小鼠體內(nèi)誘發(fā)的免疫應(yīng)答
        4.2 syngpnef+syngp120組和syngpnef-syngp120組小鼠體內(nèi)誘發(fā)的免疫應(yīng)答
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄



本文編號(hào)：3839975