發(fā)布時間：2023-06-06 19:12

　　目的: 分別構建HBV截短型中蛋白(MHBst)真核表達載體與帶有端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子和熒光素酶的報告基因質(zhì)粒,利用體外共轉(zhuǎn)染實驗,轉(zhuǎn)入端粒酶表型不同、處于不同分化階段的多種細胞中,通過檢測熒光素酶活性,探討MHBst對hTERT啟動子的調(diào)控作用,為揭示HBV相關性疾病的發(fā)生機制提供新思路。 方法: 1.乙肝病毒截短型中蛋白在肝癌細胞中的表達及其反式激活作用研究 設計引物,PCR擴增兩條長度不同的HBV截短型中蛋白基因片段,分別定向克隆入真核表達載體pcDNA3,構建重組表達質(zhì)粒pcS2與pcTS。重組子經(jīng)PCR及測序鑒定。將重組子與報告質(zhì)粒pGL3-control共轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2,檢測熒光素酶表達強度,以驗證所構建的HBV截短型中蛋白表達載體在體外的反式激活作用。為進一步研究HBV截短型中蛋白及編碼基因片段對肝癌細胞的影響,將重組質(zhì)粒pcS2和pcTS分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2,經(jīng)G418篩選,獲得陽性細胞,通過生長曲線與集落形成試驗研究MHBst對肝癌細胞的生物學特性的影響。 2.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子報告基因質(zhì)粒 ...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
前言
第一部分 構建具有反式激活作用的HBV截短型中蛋白真核表達載體
    技術路線
    1 材料
        1.1 質(zhì)粒與菌種
        1.2 細胞
        1.3 主要試劑
        1.4 試劑盒
        1.5 DNA分子量marker
        1.6 PCR引物
        1.7 一般試劑
        1.8 主要實驗儀器
    2 方法
        2.1 重組子的構建
            2.1.1 質(zhì)粒DNA的制備
            2.1.2 目的基因片斷的獲得
            2.1.3 質(zhì)粒pcDNA3的酶切線性化與回收
            2.1.4 目的基因片斷與載體的連接
            2.1.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.1.6 陽性重組子pcS2與pcTS的篩選鑒定
            2.1.7 陽性克隆的保存
        2.2 乙肝病毒截短型中蛋白表達載體反式激活作用的研究
            2.2.1 QIAprep Spin minprep試劑盒抽取與純化質(zhì)粒DNA
            2.2.2 HepG2細胞培養(yǎng)
            2.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
            2.2.4 細胞的收集與裂解
            2.2.5 熒光素酶表達量的測定
        2.3 穩(wěn)定表達的乙肝病毒截短型中蛋白對肝癌生物學特性的影響
            2.3.1 脂質(zhì)體介導HBV截短中蛋白表達載體轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2
            2.3.2 陽性克隆的穩(wěn)定篩選
            2.3.3 RT-PCR檢測HBV截短中蛋白mRNA的表達
            2.3.4 凍存穩(wěn)定篩選的陽性克隆細胞
            2.3.5 生長曲線的測定
            2.3.6 軟瓊脂集落形成實驗
    3 結(jié)果
        3.1.重組子的構
            3.1.1 質(zhì)粒的獲得
            3.1.2 PCR擴增目的基因片斷
            3.1.3 目的基因片斷和載體的酶切回收
            3.1.4 陽性重組子鑒定
        3.2.乙肝病毒截短型中蛋白的反式激活作用
            3.2.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
            3.2.2.乙肝病毒截短型中蛋白對SV40啟動子／增強子有反式激活作用
        3.3.乙肝病毒截短型中蛋白對肝癌細胞生物學特性的影響
            3.3.1 陽性克隆的穩(wěn)定篩選
            3.3.2 RT-PCR檢測HBV截短中蛋白mRNA的表達
            3.3.3 穩(wěn)定表達的截短型中蛋白抑制肝癌細胞的生長
            3.3.4 穩(wěn)定表達的截短型中蛋白抑制肝癌細胞的集落形成能力
    4 討論
第二部分 構建端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子報告質(zhì)粒
    技術路線
    1 材料
        1.1 質(zhì)粒
        1.2 細胞
        1.3 引物
        1.4 主要試劑
    2 方法
        2.1 重組子pGL3-TRTP的構建
            2.1.1 質(zhì)粒pCR—TRTP，pGL3-basic的酶切鑒定
            2.1.2 目的片斷TRTP的獲取
            2.1.3 載體pGL3-basic線性化
            2.1.4 目的片斷TRTP與載體pGL3-basic的回收與純化
            2.1.5 目的基因TRTP與載體的連接
            2.1.6 重組質(zhì)粒pGL3-TRTP的轉(zhuǎn)化
            2.1.7 陽性克隆株pGL3-TRTP的鑒定
        2.2 重組子pGL3-del445的構建
            2.2.1 目的片斷Del445的獲取
            2.2.2 質(zhì)粒pGL3-basic的酶切線性化
            2.2.3 目的基因Del445與載體pGL3-basic的連接
            2.2.4 重組質(zhì)粒pGL3-del445的轉(zhuǎn)化
            2.2.5 陽性重組子pGL3-del445的篩選鑒定
        2.3 hTERT啟動子活性的驗證
            2.3.1 原代細胞的培養(yǎng)
            2.3.2 RT-PCR檢測不同細胞系hTERT的表達
            2.3.3 hTERT啟動子活性的鑒定
    3 結(jié)果
        3.1.重組子的構建
            3.1.1 質(zhì)粒pCR-TRTP、pGL3-basic的鑒定
            3.1.2 目的基因片斷的獲得
            3.1.3 目的基因片斷與載體的酶切回收
            3.1.4 陽性重組子pGL3-TRTP、pGL3-del445的酶切篩選
            3.1.5 DNA測序及序列分析
        3.2.hTERT啟動子活性的驗證
            3.2.1 原代細胞HELF的培養(yǎng)
            3.2.2.不同細胞hTERT的表達
            3.2.3.hTERT啟動子在不同細胞系中的活性
    4 討論
第三部分 MHBst對hTERT啟動子的反式激活作用的研究
    技術路線
    1 材料
    2 方法
        2.1 不同細胞hTERT的擴增
        2.2 共轉(zhuǎn)染實驗
        2.3 細胞的收集與熒光素酶表達量的測定
        2.4 反義寡核苷酸封閉MHBst表達的最佳量
            2.4.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
            2.4.2 抽提RNA
            2.4.3 逆轉(zhuǎn)錄擴增實驗
            2.4.4 HBV截短中蛋白的PCR擴增
        2.5 反義封閉
        2.6 反義封閉后熒光素酶表達量的測定
    3 結(jié)果
        3.1 不同細胞hTERT的表達
        3.2 HBV截短中蛋白對hTERT啟動子的反式激活作用
            3.2.1 共轉(zhuǎn)染驗證其反式激活作用
            3.2.2 最佳反義寡核苷酸濃度
            3.2.3 特異性反式激活作用的驗證
    4 討論
小結(jié)
擬進展計劃
參考文獻
附圖
    第一部分附圖
    第二部分附圖
    第三部分附圖
附錄 質(zhì)粒物理圖譜
致謝
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本文編號：3832045