發(fā)布時(shí)間：2023-03-04 21:17

　　PCR擴(kuò)增日本血吸蟲28 000谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Sj28GST)的主要抗原表位與霍亂毒素B亞基(CTB)的融合基因, CTB-Sj28GST經(jīng)SalⅠ和SphⅠ雙酶切后定向克隆至轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-CTB-Sj28GST,轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行基因的同源重組,提取重組病毒,用M13通用引物以及CTB-Sj28GST引物PCR鑒定陽(yáng)性后轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾細(xì)胞(Sf9),收集親代重組病毒反復(fù)感染Sf9細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增, PCR鑒定重組病毒。重組病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí),用抗Sj28GST多克隆抗體間接免疫熒光(IFA)鑒定重組蛋白的表達(dá)情況,蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)鑒定病毒感染細(xì)胞裂解液,分析重組蛋白的抗原性。研究結(jié)果表明, Sj28GST含有4個(gè)抗原表位,長(zhǎng)189 bp,與CTB融合后長(zhǎng)519 bp。重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-CTB-Sj28GST的PCR及序列鑒定與預(yù)期一致。Sf9轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得的重組病毒經(jīng)PCR鑒定,獲得與預(yù)期一致的519 bp片段。IFA鑒定表明,重組病毒感染的Sf9細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,未感染的...

【文章頁(yè)數(shù)】：4 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細(xì)胞株、載體和菌株
    1.2 主要試劑
    1.3 引物設(shè)計(jì)
    1.4CTB-Sj28GST的PCR擴(kuò)增和pFastBac-CTB-Sj28GST重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建
    1.5 Bacmid-CTB-Sj28GST重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
    1.6 重組病毒的轉(zhuǎn)染及病毒DNA的提取鑒定
    1.7 Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組蛋白鑒定
        1.7.1 重組蛋白的間接免疫熒光鑒定
        1.7.2 重組蛋白的Western blotting鑒定
    1.8 倫理批準(zhǔn)患者知情同意
2 結(jié)果
    2.1 p FastBac-CTB-Sj28GST重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的鑒定
    2.2 Bacmid-CTB-Sj28GST重組穿梭質(zhì)粒的鑒定
    2.3 重組桿狀病毒的DNA鑒定
        2.4.1 Sf9細(xì)胞感染后變化
        2.4.2 表達(dá)蛋白的IFA檢測(cè)
        2.4.3 表達(dá)蛋白的Western blotting鑒定
3 討論



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