目的篩選和鑒定與東方田鼠抗性基因整合素連接激酶相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶(ILKAP)表達(dá)蛋白相互結(jié)合的日本血吸蟲童蟲蛋白。方法提取東方田鼠骨髓細(xì)胞蛋白和日本血吸蟲童蟲蛋白,進(jìn)行免疫共沉淀,實驗組為東方田鼠骨髓蛋白+日本血吸蟲童蟲蛋白+ILKAP抗體+磁性珠子,陰性對照組以兔IgG抗體代替ILKAP抗體,陽性對照組為東方田鼠骨髓蛋白或日本血吸蟲童蟲蛋白。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對免疫沉淀復(fù)合物進(jìn)行分離,切取差異性蛋白條帶通過基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀(MALDITOF-MS)鑒定,獲得的混合物肽片段利用Mascot軟件進(jìn)行分析檢索。分別以東方田鼠骨髓cDNA和日本血吸蟲童蟲c DNA為模板, RT-PCR擴(kuò)增東方田鼠ILKAP (Mf ILKAP)基因和日本血吸蟲表膜抗原(Sj TA)基因。將Mf ILKAP和Sj TA基因分別克隆至真核表達(dá)載體Flag-pCMV-2b和Myc-pcDNA3.1/(-) b中,構(gòu)建的重組質(zhì)粒FlagILKAP-pCMV-2b和Myc-TA-pcDNA3.1/(-) b共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中作為實驗組,設(shè)陰性對照組M...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 實驗動物來源
    1.2 主要試劑和儀器
    1.3 東方田鼠骨髓細(xì)胞的分離
    1.4 日本血吸蟲童蟲的培養(yǎng)
    1.5 東方田鼠骨髓細(xì)胞和日本血吸蟲童蟲蛋白的提取與測定
    1.6 免疫共沉淀
    1.7 MALDI-TOF-MS分析
    1.8 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    1.9 免疫共沉淀與蛋白質(zhì)印跡 (Westernblotting) 分析
    1.1 0 倫理批準(zhǔn)和患者知情同意
2 結(jié)果
    2.1 免疫共沉淀結(jié)果
    2.2 Mf ILKAP和Sj TA基因的表達(dá)分析
    2.3 Myc-TA-pcDNA3.1/ (-) b和Flag-ILKAP-pCMV-2b重組載體的構(gòu)建
    2.4 免疫共沉淀與Western blotting分析結(jié)果
3 討論



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