目的觀察不同直徑豬卵泡內(nèi)卵泡液誘導(dǎo)人羊水干細(xì)胞（human amniotic fluid stem cells,hAFSCs）-070607株向雌性生殖細(xì)胞分化的效果。探討卵泡內(nèi)微環(huán)境對(duì)體外雌性生殖細(xì)胞形成的影響。方法選取不同直徑豬卵泡內(nèi)的卵泡液（S組:直徑＜3 mm、M組:直徑3～6 mm、L組:直徑＞6 mm）,檢測(cè)卵泡液內(nèi)雌二醇（E2）和卵泡刺激素（FSH）的含量及骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）的表達(dá)。將不同分組卵泡液添加到雌性生殖細(xì)胞分化體系中,經(jīng)過(guò)5 d的體外誘導(dǎo)培養(yǎng),觀察生殖細(xì)胞基因OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和甲基化基因DNMT3B的表達(dá)變化。繼續(xù)用M組卵泡液誘導(dǎo)hAFSCs-070607,觀察基因及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果通過(guò)基因、蛋白和三胚層分化的檢測(cè),確定hAFSCs-070607具有良好的多能性及分化潛能。3組不同直徑的卵泡液內(nèi)都含有FSH,但不含E2;BMP15的未成熟蛋白在M組中的含量略高于S、L組。M組添加到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基后,E2的產(chǎn)量較高,生殖相關(guān)標(biāo)記基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和DNMT3B基因的表達(dá)依次按照大、中... 

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料與試劑
    1.2 分組
    1.3 hAFSCs-070607細(xì)胞株的鑒定
        1.3.1 PCR檢測(cè)hAFSCs-070607株的相關(guān)基因表達(dá)
        1.3.2 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)hAFSCs-070607株的相關(guān)蛋白表達(dá)
        1.3.3 hAFSCs-070607株三胚層分化實(shí)驗(yàn)
    1.4 不同直徑卵泡內(nèi)卵泡液對(duì)hAFSCs誘導(dǎo)效果檢測(cè)
        1.4.1 豬卵泡液的收集
        1.4.2 檢測(cè)不同直徑卵泡中卵泡液的卵母細(xì)胞自分泌蛋白BMP15的表達(dá)情況
        1.4.3 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)基中激素含量
        1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵泡液誘導(dǎo)后hAFSCs的相關(guān)基因表達(dá)
    1.5 M組卵泡液誘導(dǎo)hAFSCs過(guò)程中基因及蛋白表達(dá)的變化
        1.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵泡液誘導(dǎo)后hAFSCs的相關(guān)基因表達(dá)
        1.5.2 熒光顯微鏡觀察pBMP15-EGFP轉(zhuǎn)染的卵泡液誘導(dǎo)后hAFSCs
        1.5.3 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)hAFSCs-070607株的相關(guān)蛋白表達(dá)
        1.5.4 Western blot檢測(cè)
    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 hAFSCs-070607細(xì)胞株的鑒定
        2.1.1 PCR檢測(cè)hAFSCs-070607株的相關(guān)基因表達(dá)
        2.1.2 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)hAFSCs-070607株的相關(guān)蛋白表達(dá)
        2.1.3 h AFSCs-070607株三胚層分化實(shí)驗(yàn)
    2.2 不同直徑卵泡內(nèi)卵泡液對(duì)hAFSCs誘導(dǎo)效果檢測(cè)
        2.2.1 豬卵泡液的收集
        2.2.2 不同直徑卵泡中卵泡液的卵母細(xì)胞自分泌蛋白BMP15的表達(dá)情況
        2.2.3 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)基中激素含量
        2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵泡液誘導(dǎo)后hAFSCs的相關(guān)基因表達(dá)
    2.3 M組卵泡液誘導(dǎo)h AFSCs過(guò)程中基因及蛋白表達(dá)的變化
        2.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵泡液誘導(dǎo)后hAFSCs的相關(guān)基因表達(dá)
        2.3.2 熒光顯微鏡觀察pBMP15-EGFP轉(zhuǎn)染的卵泡液誘導(dǎo)后hAFSCs
        2.3.3 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)hAFSCs-070607株的相關(guān)蛋白表達(dá)
        2.3.4 Western blot檢測(cè)
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體內(nèi)分化模型的建立[J]. 俞曉麗,王寧,馬洋洋,萬(wàn)千惠,秦明鳴,王華巖.  生物工程學(xué)報(bào). 2015(03)



本文編號(hào)：3690908