慢性乙型病毒性肝炎是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染病，全世界約3億人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），占世界人口的5％，年均感染率約為5千萬(wàn)人。我國(guó)是HBV感染高發(fā)區(qū)，HBV攜帶者達(dá)1億人，約占我國(guó)人口10％。HBV感染者中，約5％～10％成人和80％～90％兒童感染者不能清除病毒，發(fā)展成為慢性乙肝患者或攜帶者，其中約5％～20％慢性感染者最后發(fā)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌。對(duì)慢性乙型病毒性肝炎的治療和預(yù)防一直是世界性難題，以IFN-α和拉米芙定為主的藥物治療能抑制病毒復(fù)制，但有效應(yīng)答率低、療程長(zhǎng)、費(fèi)用高，治療效果并不令人滿意，且存在停藥后的反跳和長(zhǎng)期用藥帶來(lái)的抗藥性及病毒變異等問(wèn)題，一般認(rèn)為，疫苗接種是預(yù)防和治療慢性乙肝最安全有效而且價(jià)廉的措施。 自1997年世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦實(shí)施乙肝疫苗計(jì)劃免疫以來(lái)，大范圍的疫苗接種有效降低了HBV感染率，為預(yù)防慢性乙肝做出了突出貢獻(xiàn)，但只含S抗原的基因工程疫苗的不應(yīng)答或低應(yīng)答率高達(dá)10％～15％，且不能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，不能誘導(dǎo)慢性HBV感染者或攜帶者產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)答，因此，其治療性意義不大。慢性乙肝感染者或攜帶者... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
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前言
第一部分 HBc及HBV多表位嵌合基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實(shí)驗(yàn)方法
            (一) 、 HBV多表位基因的設(shè)計(jì)與合成
            (二) 、 脊區(qū)基因缺失的HBc真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
                1 、 PCR擴(kuò)增HBc1～72aa及HBc93～183aa編碼序列
                2 、 脊區(qū)基因缺失的HBc基因(HBcdM)的克隆
                3 、 重組克隆的篩選及鑒定
            (三) 、 多表位合成基因(BPT)的克隆及重組子篩選、鑒定
                1 、 PCR擴(kuò)增多表位基因BPT
                2 、 BPT基因的克隆及重組子篩選、鑒定
    結(jié)果
        (一) 基因擴(kuò)增
        (二) 脊區(qū)缺失的HBc真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定
        (三) 多表位基因(BPT)的克隆及重組子篩選、鑒定
    討論
    小結(jié)
第二部分 HBc及HBV多表位嵌合基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞NS-1內(nèi)的表達(dá)及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選與鑒定
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實(shí)驗(yàn)方法
            (一) 真核表達(dá)載體pHBcMep轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞
                1 、 質(zhì)粒pHBcMep的擴(kuò)增與純化
                2 、 基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞克隆篩選
            (二) 嵌合基因HBcMep穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選
            (三) 重組NS/HBcMep細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物鑒定
                1 、 RT-PCR檢測(cè)
                2 、 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清重組蛋白HBcMep的表達(dá)情況
                3 、 間接免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)情況
                4 、 Western blot檢測(cè)
            (四) NK細(xì)胞活性檢測(cè)
    結(jié)果
        一、 真核表達(dá)載體pHBcMep轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞
            1 、 質(zhì)粒的擴(kuò)增、純化與鑒定
            2 、 pHBcMep轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定
        二、 穩(wěn)定表達(dá)重組NS/HBcMep細(xì)胞株的篩選和表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
            1 、 RT-PCR
            2 、 間接免疫熒光
            3 、 Western-Blot
        三、 BALB/c小鼠脾細(xì)胞對(duì)重組NS/HBcMep細(xì)胞的NK細(xì)胞活性
    討論
    小結(jié)
第三部分 HBc及HBV多表位嵌合基因免疫BALB/c小鼠所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答研究
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實(shí)驗(yàn)方法
            (一) 質(zhì)粒制備與純化
            (二) 動(dòng)物分組與免疫
            (三) ELISA檢測(cè)免疫血清抗preS2抗體
            (四) cELISA檢測(cè)免疫血清抗HBcMep抗體
            (五) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫小鼠CD_4/CD_8比值
            (六) LDH法檢測(cè)免疫小鼠的特異性CTL活性
                1 、 刺激細(xì)胞的處理
                2 、 脾細(xì)胞的收獲與預(yù)處理
                3 、 LDH法檢測(cè)CTL活性
            (七) 安全性試驗(yàn)
    結(jié)果
        (一) 質(zhì)粒的擴(kuò)增、純化及鑒定
        (二) ELISA檢測(cè)免疫血清抗preS2抗體
        (三) cELISA檢測(cè)免疫血清抗HBcMep抗體
        (四) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫小鼠CD_4/CD_8比值
        (五) LDH法檢測(cè)免疫小鼠的特異性CTL活性
        (六) 安全性試驗(yàn)
    討論
    小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
致謝
附錄: 碩士期間論文發(fā)表情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答[J]. 趙平,姜春鵬,趙蘭娟,溫新宇,戚中田.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2002(04)
[2]乙肝表面抗原核酸疫苗在小鼠體內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)[J]. 溫劍平,楊貴貞.  中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2002(03)
[3]重組治療性乙型肝炎疫苗（YIC）的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 聞?dòng)衩?何麗芳,瞿滌,馬張妹,姚忻.  中國(guó)工程科學(xué). 1999(01)
[4]用細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附法篩選分泌抗人B細(xì)胞分化抗原單抗的雜交瘤[J]. 郭彩云,石偉,王汛,朱立平.  基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床. 1995(02)



本文編號(hào)：3633797