發(fā)布時間：2022-02-19 23:06

　　慢性乙型病毒性肝炎是嚴重危害人類健康的傳染病，全世界約3億人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），占世界人口的5％，年均感染率約為5千萬人。我國是HBV感染高發(fā)區(qū)，HBV攜帶者達1億人，約占我國人口10％。HBV感染者中，約5％～10％成人和80％～90％兒童感染者不能清除病毒，發(fā)展成為慢性乙肝患者或攜帶者，其中約5％～20％慢性感染者最后發(fā)展為肝硬化或肝細胞癌。對慢性乙型病毒性肝炎的治療和預防一直是世界性難題，以IFN-α和拉米芙定為主的藥物治療能抑制病毒復制，但有效應答率低、療程長、費用高，治療效果并不令人滿意，且存在停藥后的反跳和長期用藥帶來的抗藥性及病毒變異等問題，一般認為，疫苗接種是預防和治療慢性乙肝最安全有效而且價廉的措施。 自1997年世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦實施乙肝疫苗計劃免疫以來，大范圍的疫苗接種有效降低了HBV感染率，為預防慢性乙肝做出了突出貢獻，但只含S抗原的基因工程疫苗的不應答或低應答率高達10％～15％，且不能誘導有效的細胞免疫應答，不能誘導慢性HBV感染者或攜帶者產(chǎn)生保護性應答，因此，其治療性意義不大。慢性乙肝感染者或攜帶者... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
縮寫詞
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 HBc及HBV多表位嵌合基因真核表達質(zhì)粒的構建與鑒定
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實驗方法
            (一) 、 HBV多表位基因的設計與合成
            (二) 、 脊區(qū)基因缺失的HBc真核表達載體的構建與鑒定
                1 、 PCR擴增HBc1～72aa及HBc93～183aa編碼序列
                2 、 脊區(qū)基因缺失的HBc基因(HBcdM)的克隆
                3 、 重組克隆的篩選及鑒定
            (三) 、 多表位合成基因(BPT)的克隆及重組子篩選、鑒定
                1 、 PCR擴增多表位基因BPT
                2 、 BPT基因的克隆及重組子篩選、鑒定
    結果
        (一) 基因擴增
        (二) 脊區(qū)缺失的HBc真核表達載體構建與鑒定
        (三) 多表位基因(BPT)的克隆及重組子篩選、鑒定
    討論
    小結
第二部分 HBc及HBV多表位嵌合基因在哺乳動物細胞NS-1內(nèi)的表達及其穩(wěn)定表達細胞株的篩選與鑒定
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實驗方法
            (一) 真核表達載體pHBcMep轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞
                1 、 質(zhì)粒pHBcMep的擴增與純化
                2 、 基因轉(zhuǎn)染及細胞克隆篩選
            (二) 嵌合基因HBcMep穩(wěn)定表達細胞株的篩選
            (三) 重組NS/HBcMep細胞表達產(chǎn)物鑒定
                1 、 RT-PCR檢測
                2 、 ELISA檢測培養(yǎng)上清重組蛋白HBcMep的表達情況
                3 、 間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染細胞的表達情況
                4 、 Western blot檢測
            (四) NK細胞活性檢測
    結果
        一、 真核表達載體pHBcMep轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞
            1 、 質(zhì)粒的擴增、純化與鑒定
            2 、 pHBcMep轉(zhuǎn)染細胞的篩選與鑒定
        二、 穩(wěn)定表達重組NS/HBcMep細胞株的篩選和表達產(chǎn)物的鑒定
            1 、 RT-PCR
            2 、 間接免疫熒光
            3 、 Western-Blot
        三、 BALB/c小鼠脾細胞對重組NS/HBcMep細胞的NK細胞活性
    討論
    小結
第三部分 HBc及HBV多表位嵌合基因免疫BALB/c小鼠所誘導的免疫應答研究
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實驗方法
            (一) 質(zhì)粒制備與純化
            (二) 動物分組與免疫
            (三) ELISA檢測免疫血清抗preS2抗體
            (四) cELISA檢測免疫血清抗HBcMep抗體
            (五) 流式細胞術檢測免疫小鼠CD_4/CD_8比值
            (六) LDH法檢測免疫小鼠的特異性CTL活性
                1 、 刺激細胞的處理
                2 、 脾細胞的收獲與預處理
                3 、 LDH法檢測CTL活性
            (七) 安全性試驗
    結果
        (一) 質(zhì)粒的擴增、純化及鑒定
        (二) ELISA檢測免疫血清抗preS2抗體
        (三) cELISA檢測免疫血清抗HBcMep抗體
        (四) 流式細胞術檢測免疫小鼠CD_4/CD_8比值
        (五) LDH法檢測免疫小鼠的特異性CTL活性
        (六) 安全性試驗
    討論
    小結
結論
參考文獻
綜述
致謝
附錄: 碩士期間論文發(fā)表情況


【參考文獻】：
期刊論文
[1]HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗誘導小鼠持久的細胞免疫應答[J]. 趙平,姜春鵬,趙蘭娟,溫新宇,戚中田.  生物化學與生物物理進展. 2002(04)
[2]乙肝表面抗原核酸疫苗在小鼠體內(nèi)的陽性表達[J]. 溫劍平,楊貴貞.  中國免疫學雜志. 2002(03)
[3]重組治療性乙型肝炎疫苗（YIC）的實驗研究[J]. 聞玉梅,何麗芳,瞿滌,馬張妹,姚忻.  中國工程科學. 1999(01)
[4]用細胞酶聯(lián)免疫吸附法篩選分泌抗人B細胞分化抗原單抗的雜交瘤[J]. 郭彩云,石偉,王汛,朱立平.  基礎醫(yī)學與臨床. 1995(02)



本文編號：3633797