發(fā)布時間：2017-05-13 04:01

  本文關(guān)鍵詞：副溶血弧菌調(diào)控蛋白CalR功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一種廣泛分布于淺海海水,入海港灣,海洋生物及鹽漬加工食品中,能引起人類感染患病的革蘭氏陰性嗜鹽弧菌。人們?nèi)粽`食了生的或未被徹底煮熟的海產(chǎn)品,可能會被感染。副溶血弧菌主要能夠引起三種臨床綜合癥:腸胃炎、傷口感染和敗血癥。其中最常見是腸胃炎,癥狀包括腹瀉、腹痛、反胃嘔吐、頭痛和低熱。副溶血弧菌分泌多種毒力因子,主要包括耐熱直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin,TDH),TDH相關(guān)溶血毒素(TDH-related hemolysin,TRH),III型分泌系統(tǒng)(The type III secretion systems,T3SS),VI型分泌系統(tǒng)(The type VI secretion systems,T6SS)及莢膜多糖等。其中TDH可在我妻血瓊脂平板上表現(xiàn)為神奈川現(xiàn)象陽性。目前在我國沿海地區(qū),由副溶血弧菌感染引起的食源性疾病占這些地區(qū)食源性中毒病例的比例越來越高,所以有必要對其致病機(jī)理進(jìn)行深入探討。Leu O是Lys R家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,廣泛存在于腸道致病菌中。首先被發(fā)現(xiàn)于沙門氏菌(Salmonella)中,且因其能激活亮氨酸合成基因座位leu ABCD的轉(zhuǎn)錄而得名。在隨后的研究表明,Leu O具有解除靜默子H-NS對基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用,并參與調(diào)控多種基因,因此被認(rèn)為是重要的核心調(diào)控子。副溶血弧菌的cal R基因位于菌株基因組I上,該基因長960 bp,G+C含量47.29%,編碼分子量為36192.8,由319氨基酸殘基組成的蛋白。Cal R是Leu O的同源蛋白,其自身的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受鹽度和Ca2+濃度的雙重調(diào)節(jié)。目前只知它具有抑制T3SS1毒力基因的表達(dá)和細(xì)菌群集性爬動能力(Swarming),但對其分子機(jī)制還一無所知。目的:本文目的在于通過構(gòu)建副溶血弧菌cal R基因的突變株、回補(bǔ)株和CalR蛋白表達(dá)株,進(jìn)而對Cal R功能進(jìn)行初步研究。方法:本研究首先利用自殺載體p DS132同源重組的方法構(gòu)建副溶血弧菌RIMD2210633菌株的cal R無痕突變株(Δcal R),并在突變株的基礎(chǔ)上構(gòu)建了回補(bǔ)株(Δcal R/cal R::p BAD33,簡稱C-Δcal R)和攜帶有相關(guān)靶基因的Lac Z菌株。通過測定并比較vop N基因(編碼T3SS1外膜蛋白)在WT/p BAD33、Δcal R/p BAD33和C-Δcal R中β-半乳糖苷酶活性的差異,來判定Cal R對vop N的調(diào)控關(guān)系,明確Δcal R是否為非極性突變株;其次,比較WT和cal R突變株在對應(yīng)激條件下的適應(yīng)性、菌落透明度、運動能力、生物膜的形成和細(xì)胞毒力等一系列的表型實驗結(jié)果,其中應(yīng)激環(huán)境選擇了溫度,鹽度和酸度三個不同的條件;利用構(gòu)建好的靶基因Lac Z菌株進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測,判斷調(diào)控因子Cal R與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系;最后用重組克隆方法誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,鎳柱純化后可得到純度高的Cal Rhis6蛋白,從而對其DNA活性分析和Cal Rhis6蛋白與靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合活性檢測奠定基礎(chǔ)。結(jié)果:Cal R負(fù)調(diào)控vop N的轉(zhuǎn)錄,且回補(bǔ)株的回補(bǔ)效果良好,表明本研究成功構(gòu)建了副溶血弧菌cal R基因的無痕突變株和回補(bǔ)株。表型實驗中:在對溫度(4℃)應(yīng)激條件下的適應(yīng)性上,一定時間段內(nèi)(第二天),WT的適應(yīng)能力明顯高于Δcal R;Δcal R生物膜的形成能力高于WT;菌落透明度上,與WT相比,Δcal R更加透明;在運動能力上,Δcal R的爬動能力小于WT,而泳動能力與WT比較無顯著性差異;Δcal R的細(xì)胞毒力和溶血活性都大于WT;Lac Z報告基因融合實驗結(jié)果顯示:cal R能激活cps A轉(zhuǎn)錄活性,對exs A,exs B,vop N,syp G,tdh A的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用,而對syp A轉(zhuǎn)錄無調(diào)控作用。Cal Rhis6蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)并被純化。結(jié)論:副溶血弧菌中的Cal R對應(yīng)激環(huán)境中細(xì)菌的適應(yīng)性、生物膜的形成、動力,透明度、細(xì)胞毒和溶血活性等都有一定的調(diào)節(jié)作用,具有抑制T3SS1和Vp-PAI的轉(zhuǎn)錄活性。
【關(guān)鍵詞】：副溶血弧菌 calR 突變株 回補(bǔ)株 表型實驗
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 緒論12-24
• 1.1 副溶血弧菌的生物學(xué)特性12
• 1.1.1 形態(tài)染色12
• 1.1.2 培養(yǎng)特性12
• 1.1.3 生化反應(yīng)12
• 1.2 副溶血弧菌毒力研究概述12-17
• 1.2.1 耐熱直接溶血素（TDH）和相關(guān)溶血素（TRH）13-14
• 1.2.2 III型分泌系統(tǒng)14-15
• 1.2.3 VI型分泌系統(tǒng)15-16
• 1.2.4 多種酶類16
• 1.2.5 粘附因子16-17
• 1.2.6 不耐熱的溶血素17
• 1.3 弧菌生物膜形成17-20
• 1.3.1 鞭毛17-19
• 1.3.2 IV型菌毛（type IV pilus）19-20
• 1.3.3 多糖20
• 1.4 細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum sensing，QS）20-21
• 1.5 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Cal R的研究進(jìn)展21-22
• 1.6 本文研究目的和路線22-24
• 第二章 材料方法24-43
• 2.1 實驗材料24-30
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒24
• 2.1.2 主要試劑24
• 2.1.3 主要溶液24-28
• 2.1.4 主要儀器28-29
• 2.1.5 本文引物匯總29-30
• 2.2 實驗方法30-43
• 2.2.1 cal R基因的敲除30-32
• 2.2.2 cal R回補(bǔ)株的構(gòu)建32-33
• 2.2.3 表型實驗33-36
• 2.2.4 Lac Z報告基因融合實驗36-39
• 2.2.5 重組蛋白Cal R（Cal Rhis6）的克隆表達(dá)39-43
• 第三章 實驗結(jié)果與討論43-58
• 3.1 cal R突變株和回補(bǔ)株的構(gòu)建與驗證43-47
• 3.1.1 cal R突變株的構(gòu)建43-44
• 3.1.2 回補(bǔ)株構(gòu)建44-46
• 3.1.3 非極性突變株的驗證46-47
• 3.2 表型實驗和相關(guān)基因Lac Z實驗47-53
• 3.2.1 菌株對應(yīng)激條件的適應(yīng)性47-48
• 3.2.2 菌落透明度48-49
• 3.2.3 菌株動力實驗（Swimming和Swarming）49
• 3.2.4 菌株生物膜形成實驗49-51
• 3.2.5 Cal R對菌株溶血活性調(diào)控51-52
• 3.2.6 Cal R對菌株細(xì)胞毒調(diào)控52-53
• 3.3 Cal Rhis6蛋白的表達(dá)53-55
• 3.3.1 目的基因片段的擴(kuò)增53
• 3.3.2 Cal Rhis6蛋白表達(dá)載體重組克隆的鑒定53-54
• 3.3.3 Cal Rhis6蛋白預(yù)表達(dá)與純化54-55
• 3.4 討論55-58
• 3.4.1 cal R突變株和回補(bǔ)株的構(gòu)建55-56
• 3.4.2 Cal R對菌株表型的調(diào)控56-58
• 第四章 主要結(jié)論及展望58-59
• 4.1 主要結(jié)論58
• 4.2 下一步的研究方向58-59
• 參考文獻(xiàn)59-69
• 致謝69-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章71

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