目的構(gòu)建帶有親和素標(biāo)簽的漢灘病毒（HTNV）核衣殼蛋白（NP）表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞并表達(dá)后,鑒定與其相互作用的宿主蛋白。方法合成親和素標(biāo)簽基因（SF）與HTNV NP基因,先后克隆入哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體pCAGGS,構(gòu)建帶有親和標(biāo)簽SF的HTNV NP表達(dá)質(zhì)粒,酶切鑒定重組質(zhì)粒,獲得的重組質(zhì)粒命名為pCAGGS-SF-NP。將重組表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中, Western blot法檢測重組質(zhì)粒的表達(dá);瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并收獲蛋白樣品,與StrepTrap^TM HP瓊脂珠混勻后, 4℃過夜孵育;轉(zhuǎn)移到層析柱中,經(jīng)緩沖液洗滌、脫硫生物素洗脫完成親和層析,獲得洗脫樣本;洗脫樣品進(jìn)行SDS-PAGE,分離得到與NP相互作用的宿主蛋白。結(jié)果酶切鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重組質(zhì)粒成功表達(dá)串聯(lián)SF與NP的融合蛋白;在親和層析過程中,成功特異富集融合蛋白SF-NP;洗脫樣品成功分離出與NP相互作用的宿主蛋白。結(jié)論構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)�？梢栽谡婧思�(xì)胞中成功表達(dá)融合蛋白SF-NP并獲得了與NP相互作用的宿主蛋白。 

【文章來源】：細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2019,35(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

圖1雙酶切鑒定pCAGGS-SF載體的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果M:DNAmarker;1

余濃縮洗脫液樣本進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀察蛋白條帶。2結(jié)果2．1重組載體的酶切鑒定用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定基因SF與載體pCAGGS的連接產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示在5000bp及250bp左右分別出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期條帶大小相符(SF基因約為240bp)，證明pCAGGS-SF連接成功(圖1)。隨后將NP基因與pCAGGS-SF進(jìn)行連接，用EcoＲⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示在1500bp左右出現(xiàn)特異條帶，與SF-NP大小相符，證明pCAGGS-SF-NP質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。M:DNAmarker;1、2:KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定產(chǎn)物．圖1雙酶切鑒定pCAGGS-SF載體的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果M:DNAmarker;1、2:EcoＲⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定產(chǎn)物．圖2雙酶切鑒定pCAGGS-SF-NP載體的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果2．2NP融合蛋白的Westernblot鑒定Westernblot法鑒定pCAGGS-SF-NP質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NP組在Mr60000附近分別有一條蛋白條帶，與SF-NP大小一致，而對照組即空載體(Vec)組并沒有相應(yīng)條帶，證明pCAGGS-SF-NP質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)成功。A:小鼠抗NPmAb1A8;B:兔抗FLAGpAb;C:小鼠抗StrepmAb．M:蛋白Mrmarker;NP組:轉(zhuǎn)染pCAGGS-SF-NP;Vec組:轉(zhuǎn)染pCAGGS-SF．圖3Westernblot法鑒定pCAGGS-SF-NP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞裂解液的結(jié)果2．3與NP相互作用蛋白的親和純化對HEK293T細(xì)胞裂解液進(jìn)行親和層析，從而獲得了高濃度的目的蛋白。在親和層析的過程中，留取了每一步的液體，檢測其蛋白濃度并進(jìn)行Westernblo

GGS-SF-NP載體的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果2．2NP融合蛋白的Westernblot鑒定Westernblot法鑒定pCAGGS-SF-NP質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NP組在Mr60000附近分別有一條蛋白條帶，與SF-NP大小一致，而對照組即空載體(Vec)組并沒有相應(yīng)條帶，證明pCAGGS-SF-NP質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)成功。A:小鼠抗NPmAb1A8;B:兔抗FLAGpAb;C:小鼠抗StrepmAb．M:蛋白Mrmarker;NP組:轉(zhuǎn)染pCAGGS-SF-NP;Vec組:轉(zhuǎn)染pCAGGS-SF．圖3Westernblot法鑒定pCAGGS-SF-NP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞裂解液的結(jié)果2．3與NP相互作用蛋白的親和純化對HEK293T細(xì)胞裂解液進(jìn)行親和層析，從而獲得了高濃度的目的蛋白。在親和層析的過程中，留取了每一步的液體，檢測其蛋白濃度并進(jìn)行Westernblot分析(圖4)。pCAGGS-SF組和pCAGGS-SF-NP組流洗液中的蛋白濃度隨著洗滌次數(shù)的增加而降低，最終在第5次洗滌后接近于零，說明與瓊脂珠非特異結(jié)合的蛋白已基本去除(圖4A)。在洗脫過程中，隨著脫硫生物素的加入，在圖中箭頭處，pCAGGS-SF-NP組樣本中可以看到一個(gè)峰值，說明特異性與瓊脂珠結(jié)合的融合蛋白SF-NP被競爭脫落，經(jīng)超濾后獲得的樣本即僅含SF-NP及其相互作用蛋白。Westernblot結(jié)果顯示(圖4B)，在裂解液和洗脫液的泳道中，均在相對分子質(zhì)量(Mr)60000左右處出現(xiàn)一條蛋白條帶，而流洗液中并未出現(xiàn)，表明洗滌過程充分去除了非特異結(jié)合蛋白;同時(shí)可以看到，洗脫液泳道中蛋白條帶明顯粗于裂解液泳道的蛋白條帶，表明親和層析過程富集SF-NP的效果非常明顯。收獲的樣品SDS-PAGE后經(jīng)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]連續(xù)性腎替代療法在重癥腎綜合征出血熱患者中的臨床治療效果[J]. 陳天月,張學(xué)峰,孟晨鑫.  黑龍江醫(yī)藥. 2018(05)
[2]東南沿海地區(qū)1980-2015年漢坦病毒分子特征及流行病學(xué)分析[J]. 黃鵬,楊章女,劉源,姚蘋蘋,胡建利,王笑辰,俞建家,李軍,韓亞萍,金柯,楊龍,張?jiān)?岳明.  中國媒介生物學(xué)及控制雜志. 2017(04)
[3]Hantavirus infection:a global zoonotic challenge[J]. Hong Jiang,Xuyang Zheng,Limei Wang,Hong Du,Pingzhong Wang,Xuefan Bai.  Virologica Sinica. 2017(01)
[4]2型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的表達(dá)及其相互作用蛋白的純化[J]. 翁代慧,雷迎峰,董陽超,韓佩君,葉傳濤,楊敬,王媛,尹文.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2015(12)

博士論文
[1]我國南方地區(qū)蝙蝠漢坦病毒的分子流行病學(xué)與血清學(xué)研究[D]. 徐琳.軍事科學(xué)院 2018

碩士論文
[1]lncRNA NEAT1調(diào)控宿主抗?jié)h灘病毒固有免疫應(yīng)答分子機(jī)制的初步研究[D]. 馬宏煒.第四軍醫(yī)大學(xué) 2017



本文編號：3603506