可溶性CD14檢測體系的建立及其應(yīng)用研究 CD14是革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）的高親和力受體之一。除LPS外，CD14還介導(dǎo)肽聚糖（PGN）、脂磷壁酸（LTA）、脂蛋白等多種病原體成分與細(xì)胞的反應(yīng)，它是天然免疫中重要的模式識別分子。CD14有兩種存在形式：細(xì)胞膜表面的膜型受體（mCD14）和可溶性受體（sCD14）。sCD14存在于人體血液，腦脊液等體液中，在感染、創(chuàng)傷、燒傷和SLE等多種疾病中，sCD14的水平會升高，且與疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。目前sCD14已成為機體單核／巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志，用于監(jiān)測疾病的發(fā)生和發(fā)展。 國內(nèi)關(guān)于sCD14的研究極少，究其原因，與目前尚無國產(chǎn)試劑盒而國外進口試劑盒價格昂貴有關(guān)。為解決這一困難，推動該領(lǐng)域的研究，并為國內(nèi)關(guān)于CD14的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供技術(shù)支持，本研究建立了人sCD14單多抗雙夾心ELISA檢測體系；同時，還從人血漿中提取了天然sCD14，并進行了人CD14基因的克隆和表達(dá)，為在后續(xù)工作能深入研究CD14的生物學(xué)功能，探討CD14與Toll樣受體的相互作用以及在抗感染免疫中發(fā)揮的作用奠定了必要的基礎(chǔ)。 一、建... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

一人THPI一CD14細(xì)胞總RNAFig.2召To扭1RNAfromTHPI一CD14圖2一RT一PCR擴增人CD14全長基因Fig·2礴DNAseg皿entsofhumanCD14byRT一PCR

3:Clone4digestodbyEeoIU&Xbal4:Clone5digestodbyEeoRI&Xbal圖2一7重組載體pUCmTzeDi4的單酶切鑒定Fig.2一7ldentineationofPUCmT/CD14byEeoRIl:MarkerDL150002:Clone2digestedbyEeoRI3:Clone4digestedbyEeoRI4:Clone5digestedbyEeoRI四、構(gòu)建重組人CD14原核表達(dá)載體將構(gòu)建的重組pET28b/cD14質(zhì)粒轉(zhuǎn)化T叩一10F’感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定。如圖2一8，PCR鑒定擴增出約1000bp的基因片斷，用BamHI和EcoRI雙酶切也出現(xiàn)了約1000bp的基因片斷(圖2一9)，均與預(yù)期結(jié)果一致。對該陽性克隆進行測序鑒定，證明本實驗成功構(gòu)建了pET28b/cD14原核表達(dá)載體，目的基因插入表達(dá)載體中，讀碼框正確。

l:MafkerDL20002:PCRProductofPET28b/CD14圖2一9Bamm&Ec。班雙酶切鑒定重組PET28blCD14質(zhì)粒Fig.2一9Iden成eationofPET28b/CD14byBamm&Eeoml:MarkerDL20002:PET28b/CD14digestedbyBamHI&ECORI五、SDS一pAGE鑒定reDi4原核表達(dá)蛋白重組pET28b/CD14質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌，經(jīng)過IPTo誘導(dǎo)表達(dá)后，與空載體對照和誘導(dǎo)前表達(dá)菌對照相比，表達(dá)菌經(jīng)誘導(dǎo)后在66kDa和43kDa之間出現(xiàn)了較明顯的表達(dá)蛋白，蛋白分子量與預(yù)期一致(圖2一10)。六、分析重組蛋白在大腸桿菌中的分布和存在形式及Westernblot鑒定如圖2一11cD14重組蛋白是以包涵體形式存在，表達(dá)菌超聲后上清中沒有可溶性重組蛋白，Westemblot結(jié)果證明重組蛋白能夠與小鼠抗人CD14單抗60bca特異性結(jié)合。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]動態(tài)觀察急性腦血管病患者血漿腫瘤壞死因子-α含量變化的臨床意義[J]. 畢國榮,盧麗萍,劍非.  臨床神經(jīng)病學(xué)雜志. 1999(02)



本文編號：3602105