為制備兔抗人hUTP14a多克隆抗體并鑒定其抗體的特異性,本研究通過桿狀病毒/昆蟲表達系統(tǒng)制備并純化Flag-hUTP14a-his蛋白,免疫新西蘭家兔。ELISA方法檢測免疫兔的抗血清滴度達到1∶10⁵（體積比）時取血清,并通過Protein A免疫親和層析柱純化抗體。在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）中過表達Flag-hUTP14a,或用小干擾RNA（small interference RNA, siRNA）沉默內(nèi)源的hUTP14a蛋白表達后,提取細胞總蛋白質(zhì)。經(jīng)Western印跡分析制備的多克隆抗體的特異性;通過細胞免疫化學(xué)染色、細胞免疫熒光、免疫組織化學(xué)染色和免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）實驗對hUTP14a抗體的特異性進行鑒定。研究證實,制備的抗hUTP14a多克隆抗體能夠特異性識別內(nèi)源及外源表達的hUTP14a蛋白。該抗體可以用于細胞免疫熒光、細胞免疫化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色、Western印跡及免疫沉淀等技術(shù),為進一步研究hUTP14a的生物學(xué)... 

【文章來源】：中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2019,35(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 構(gòu)建pFastbac I重組桿狀病毒質(zhì)粒
    1.3 重組桿狀病毒感染Sf9細胞
    1.4 重組Flag-hUTP14a-His蛋白的表達、純化及鑒定
    1.5 純化的Flag-hUTP14a-his蛋白免疫新西蘭大白兔, 制備抗hUTP14a多克隆抗體
    1.6 Protein A親和層析法純化兔抗人hUTP14a IgG
    1.7 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
    1.8 細胞總蛋白質(zhì)的提取和Western 印跡
    1.9 免疫熒光和細胞化學(xué)染色
    1.10 免疫組織化學(xué)染色
    1.11 免疫沉淀 (IP)
2 結(jié)果
    2.1 采用藍白斑篩選及PCR方法鑒定重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-Flag-hUTP14a-His并測序
    2.2 重組的桿狀病毒感染昆蟲細胞
    2.3 P2代病毒感染昆蟲細胞時的稀釋比例的確定
    2.4 Ni珠純化Flag-hUTP14a-His蛋白和純化蛋白質(zhì)的定量
    2.5 用Western印跡檢測hUTP14a抗體的特異性
    2.6 免疫化學(xué)染色方法和間接免疫熒光的方法在細胞中檢測hUTP14a抗體的特異性
    2.7 用免疫組織化學(xué)染色方法在臨床腫瘤組織檢測hUTP14a抗體的特異性
    2.8 用免疫沉淀的方法檢測抗hUTP14a抗體的特異性
3 討論


【參考文獻】：
期刊論文
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