本文關(guān)鍵詞：VZV糖蛋白E基因胞外域的克隆、表達(dá)及其應(yīng)用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:分別用原核和真核細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,g E)的基因胞外域,對融合蛋白進(jìn)行特異性鑒定和免疫反應(yīng)性分析,將這兩種融合蛋白分別免疫新西蘭家兔,制備兔抗VZV g E多克隆抗體;應(yīng)用融合蛋白作為抗原建立檢測VZV特異性抗體的血清學(xué)試驗,開展對VZV感染的流行病學(xué)調(diào)查,以評價VZV疫苗的免疫效果,為易感人群VZV感染的診斷和治療以及水痘預(yù)防措施的制定提供重要的實驗依據(jù),并為研制安全性更高的VZV g E亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。方法:從臨床采集帶狀皰疹患者的皮膚囊泡液接種至單層人胚胎成纖維細(xì)胞(human embryo fibroblast,HF),進(jìn)行病毒分離;對分離的病毒株進(jìn)行特征性細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),間接免疫熒光和DNA測序鑒定。將確認(rèn)的VZV臨床分離株體外培養(yǎng),PCR擴(kuò)增VZV g E基因胞外域片段,分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒g E-p ET-32a(+)和真核表達(dá)質(zhì)粒g E-p CDNA3.1/myc-His(-),測序后將原核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo),獲得VZV g E原核表達(dá)的融合蛋白。通過SDS-PAGE電泳、Western blot鑒定融合蛋白的特異性,利用Ni2+-NTA柱對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化及柱上復(fù)性。將真核質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)VZV g E蛋白的細(xì)胞株,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA柱純化;通過RT-PCR檢測VZV g E基因的m RNA,Western blot和間接免疫熒光檢測g E融合蛋白的免疫反應(yīng)性。分別用純化后的原核表達(dá)g E蛋白和真核表達(dá)g E蛋白免疫新西蘭家兔,獲得兔抗VZV g E多克隆抗體。ELISA法分別測定該抗體及其效價。應(yīng)用真核細(xì)胞表達(dá)的g E重組抗原包被ELISA酶標(biāo)板,建立VZV抗體檢測的血清學(xué)試驗。對127份0~10歲正常兒童血清中VZV Ig G抗體水平進(jìn)行檢測,以評價VZV疫苗的免疫效果。結(jié)果:利用原核表達(dá),成功誘導(dǎo)表達(dá)出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鑒定表明其為包涵體表達(dá),表達(dá)量約為3.01 mg/ml,Ni2+-NTA柱純化后,g E蛋白純度約為90%。Western blot顯示,經(jīng)變性、復(fù)性后的該融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV g E多克隆抗體,ELISA測定顯示,多克隆抗體效價為1:6400~1:12800;利用真核表達(dá),成功篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)VZV g E基因胞外域的COS-7細(xì)胞株,RT-PCR檢測到相應(yīng)的m RNA,間接免疫熒光和Western blot鑒定,該g E融合蛋白具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性;COS-7細(xì)胞株和其培養(yǎng)液中均有g(shù) E融合蛋白,表達(dá)量約為0.632 mg/ml,Ni2+-NTA柱純化后,g E蛋白純度約為90%。免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV g E多克隆抗體,ELISA測定顯示,多克隆抗體效價為1:25600~1:51200。應(yīng)用真核g E抗原包被ELISA板,檢測了127份0~10歲兒童血清中VZV Ig G抗體,總陽性率為81.89%,特異度和靈敏度分別為93.75%和88.24%。結(jié)論:本實驗成功構(gòu)建了穩(wěn)定高效表達(dá)VZV g E蛋白的原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng),獲得較高純度的g E蛋白,有利于全面研究此蛋白的生物學(xué)功能,并為VZV亞單位疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。制備了特異性及效價較高的兔抗VZV g E多克隆抗體,建立了快速診斷VZV感染的ELISA血清學(xué)試驗,有助于VZV疫苗免疫效果的監(jiān)測和VZV感染的流行病學(xué)調(diào)查,為水痘預(yù)防措施的制定提供了重要的實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：水痘-帶狀皰疹病毒 糖蛋白E 原核表達(dá) 真核穩(wěn)定表達(dá) 多克隆抗體 血清學(xué)試驗 疫苗效果
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 第一部分VZV糖蛋白E基因胞外域的原核和真核細(xì)胞的克隆及穩(wěn)定表達(dá)11-29
• 1 引言11-14
• 1.1 VZV相關(guān)疾病11-12
• 1.2 VZV疾病的研究進(jìn)展與防治途徑12-13
• 1.3 VZV糖蛋白E的生物學(xué)功能13-14
• 2 材料和方法14-20
• 2.1 材料14-16
• 2.2 方法16-20
• 3 結(jié)果20-27
• 3.1 病毒分離與鑒定20-22
• 3.2 原核重組質(zhì)粒g E-p ET-32a(+)和真核g E-p CDNA3.1/myc-His(-) 的構(gòu)建與鑒定22-23
• 3.3 原核表達(dá)VZV gE融合蛋白的表達(dá)及柱上復(fù)性、純化的鑒定23-25
• 3.4 真核表達(dá) VZV g E 融合蛋白鑒定與純化25-27
• 4 討論27-28
• 4.1 原核表達(dá)gE重組蛋白27-28
• 4.2 真核表達(dá)gE重組蛋白28
• 5 結(jié)論28-29
• 第二部分VZV糖蛋白E的應(yīng)用研究29-44
• 1 引言29-30
• 2 材料和方法30-35
• 2.1 材料30-32
• 2.2 方法32-35
• 3 結(jié)果35-40
• 3.1 VZV g E抗原制備的多克隆抗體效價測定35
• 3.2 兔抗VZV gE多克隆抗體的特異性鑒定及純化35-37
• 3.3 Protein A親和層析柱純化兔抗VZV gE多克隆抗體37-38
• 3.4 ELISA實驗檢測臨床血清標(biāo)本38-40
• 4 討論40-43
• 4.1 VZV的臨床診斷40
• 4.2 VZV的實驗室診斷40-41
• 4.3 VZV gE糖蛋白的臨床應(yīng)用41-42
• 4.4 水痘疫苗免疫策略的探討42-43
• 4.5 本研究的不足之處及下一步研究目標(biāo)43
• 5 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 綜述50-59
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 附錄一VZV g E N端親水胞外域蛋白氨基酸序列59-60
• 附錄二 簡歷60-61
• 附錄三 致謝61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王敏力;沈琦;;水痘-帶狀皰疹免疫球蛋白研究進(jìn)展[J];中國生物制品學(xué)雜志;2007年09期

2 甘霖;王明麗;陳敬賢;;水痘減毒活疫苗的研究進(jìn)展[J];微生物與感染;2009年01期

3 伊興旭;甘霖;陳敬賢;王明麗;;水痘-帶狀皰疹病毒疫苗的評價與研究進(jìn)展[J];微生物與感染;2014年04期

  本文關(guān)鍵詞：VZV糖蛋白E基因胞外域的克隆、表達(dá)及其應(yīng)用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：357286