發(fā)布時間：2021-12-28 04:29

　　Lipocalin型前列腺素D合成酶（Lipocalin-type Prostagladin D Synthase,L-PGDS）亦稱β-trace protein，是機(jī)體組織屏障的主要成分，屬Lipocalin家族。Lipocalins為一組分子量較小的分泌性蛋白質(zhì)，它們的共同特性是可結(jié)合和運(yùn)輸親脂／疏水分子，L-PGDS為此家族中惟一有酶活性者。L-PGDS主要分布于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和雄性生殖器官，并分泌至腦脊液、血清、精液、尿液、羊水等體液中。L-PGDS是一種雙功能蛋白，除催化PGD₂產(chǎn)生外，亦可結(jié)合和運(yùn)輸親脂／疏水分子。該蛋白具有廣泛的生理學(xué)作用，它不僅與睡眠誘導(dǎo)、體溫調(diào)節(jié)、感受傷害、氣味應(yīng)答有關(guān)，亦是一種生育相關(guān)蛋白，可能參與精子的發(fā)生和成熟。研究顯示，對于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、心血管疾病、生殖系統(tǒng)疾病等，L-PGDS已成為一個有用的診斷指標(biāo)。為了建立L-PGDS的免疫學(xué)檢測方法并探討其在男性生殖系統(tǒng)中的具體功能、代謝過程、作用機(jī)制以及與男性不育的關(guān)系等，就必須得到大量的純化L-PGDS抗原和相應(yīng)的抗體。 本研究第一部分首先用PCR的... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
引言
第一部分 Lipocalin型前列腺素D合成酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑
        1.2 引物設(shè)計(jì)與合成
        1.3 測序載體的構(gòu)建及鑒定
            1.3.1 PCR擴(kuò)增L-PGDS基因片段
            1.3.2 測序載體pGEM-T/htL-PGDS的構(gòu)建
            1.3.3 鑒定和序列分析
        1.4 pPIC9/htL-PGDS重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.5 重組質(zhì)粒的鑒定
    2 結(jié)果
        2.1 L-PGDS的擴(kuò)增結(jié)果
        2.2 測序載體的構(gòu)建和序列分析
        2.3 L-PGDS真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    3 討論
第二部分 L-PGDS酵母表達(dá)菌株的建立
    1 材料和方法
        1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑
        1.2 主要試劑配制
            1.2.1 貯存液的配制
            1.2.2 培養(yǎng)基的配制
        1.3 待轉(zhuǎn)化DNA的制備
            1.3.1 質(zhì)粒pPIC9/htL-PGDS和pPIC9的線性化
            1.3.2 乙醇沉淀回收DNA
        1.4 感受態(tài)酵母細(xì)胞的制備
        1.5 L-PGDS基因的電轉(zhuǎn)化
        1.6 酵母轉(zhuǎn)化菌的鑒定
        1.7 表型的鑒定
        1.8 L-PGDS表達(dá)陽性克隆的篩選
        1.9 不同誘導(dǎo)時間重組L-PGDS的表達(dá)
        1.10 表達(dá)量的初步分析
    2 結(jié)果
        2.1 質(zhì)粒pPIC9/htL-PGDS的酵母轉(zhuǎn)化
        2.2 表型鑒定
        2.3 表達(dá)陽性克隆的篩選
        2.4 不同誘導(dǎo)時間重組L-PGDS的表達(dá)
        2.5 表達(dá)量的初步分析
    3 討論
第三部分 L-PGDS的大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定
    1 材料和方法
        1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑
        1.2 L-PGDS的大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)
        1.3 重組蛋白質(zhì)的純化
            1.3.1 硫酸氨沉淀法濃縮酵母培養(yǎng)上清
            1.3.2 鎳離子親和層析
        1.4 L-PGDS糖鏈的水解
        1.5 純化蛋白的生物學(xué)活性檢測
        1.6 重組L-PGDS的免疫印跡
    2 結(jié)果
        2.1 L-PGDS的表達(dá)、純化
        2.2 重組L-PGDS的糖基化分析
        2.3 重組L-PGDS的生物學(xué)活性
        2.4 重組L-PGDS的Western印跡
    3 討論
第四部分 分泌L-PGDS單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立與鑒定
    1 材料與方法
        1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器和方法
        1.2 免疫脾細(xì)胞制備
            1.2.1 免疫BALB／c小鼠
            1.2.2 制備免疫脾細(xì)胞懸液
        1.3 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
        1.4 細(xì)胞融合
        1.5 雜交瘤細(xì)胞觀察及換液
        1.6 分泌L-PGDS McAb陽性克隆的檢測
        1.7 陽性克隆有限稀釋
        1.8 腹水型單克隆抗體的制備
        1.9 單克隆抗體的鑒定
            1.9.1 單克隆抗體亞類測定
            1.9.2 效價測定
            1.9.3 特異性鑒定
                1.9.3.1 L-PGDS McAb與精漿中L-PGDS的蛋白印跡
                1.9.3.2 L-PGDS McAb與重組L-PGDS的蛋白印跡
                1.9.3.3 免疫阻斷試驗(yàn)
    2 結(jié)果
        2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立
        2.2 單克隆抗體亞類測定結(jié)果
        2.3 L-PGDS McAb的效價測定結(jié)果
        2.4 特異性鑒定
            2.4.1 L-PGDS McAb與精漿中L-PGDS的蛋白印跡
            2.4.2 L-PGDS McAb與重組L-PGDS的蛋白印跡
            2.4.3 免疫阻斷試驗(yàn)結(jié)果
    3 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
研究生期間主要學(xué)術(shù)成果
致謝
綜述及參考文獻(xiàn)



本文編號：3553401