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腸道病毒71型3A蛋白肽段抗體的制備

發(fā)布時(shí)間:2021-11-28 12:27
  目的制備腸道病毒71型(EV-A71)3A蛋白的肽段抗體。方法利用ExPasy和DNAstar軟件對(duì)EV-A71 3A蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性及疏水性等生物學(xué)特性進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)并合成2條14個(gè)氨基酸的多肽。用鑰孔戚血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶聯(lián)肽段作為抗原分別免疫Balb/c小鼠,免疫結(jié)束后取小鼠全血分離血清,用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)對(duì)血清中的3A蛋白抗體進(jìn)行鑒定。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示,第一條3A蛋白的多肽不能刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體,而第二條多肽能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體。結(jié)論成功制備特異性較好的3A肽段抗體,為進(jìn)一步研究3A蛋白提供了工具。 

【文章來源】:中國病毒病雜志. 2019,9(04)

【文章頁數(shù)】:5 頁

【部分圖文】:

腸道病毒71型3A蛋白肽段抗體的制備


圖1高效液相色譜法測(cè)定肽段的純度注:A為高效液相

多肽,平行樣,血清,小鼠


毒感染細(xì)胞裂解液反應(yīng),結(jié)果如圖2所示,用多肽-1免疫的小鼠血清在3A蛋白對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量11×103處未見條帶(圖2中1~3),提示多肽-1處理的的小鼠血清中沒有3A蛋白的特異性抗體,這可能是多肽-1的免疫原性較差未能刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答所致;而多肽-2免疫的小鼠血清在目標(biāo)分子量處有明顯條帶(圖2中4~6)提示多肽-2免疫的小鼠血清中存在EV-A713A蛋白的特異性抗體。2.4多肽抗體的IFA鑒定用多肽免疫的小鼠血清作為一抗,與EV-A71感染的RD細(xì)胞孵育,IFA鑒定血清中的抗體,結(jié)果如圖3所示,多肽-1免疫的小鼠血清處理的被感染細(xì)胞中未見到紅色熒光,而多肽-2免疫的小鼠血清處理的被感染細(xì)胞中有明顯紅色熒光,提示多肽-1免疫的小鼠血清中沒有能與3A有效結(jié)合的抗體,而多肽-2免疫的小鼠血清中存在3A的抗體,這與WB的結(jié)果一致。注:A為高效液相色譜法測(cè)定多肽-1的純度;B為高效液相色譜法測(cè)定多肽-2的純度。圖1高效液相色譜法測(cè)定肽段的純度注:1~3為多肽-1處理小鼠的血清平行樣本;4~6為多肽-2處理小鼠的血清平行樣本。圖2WB法檢測(cè)肽段抗體中國病毒病雜志2019年7月第9卷第4期ChinJViralDis,July2019,Vol.9No.4·562·

多肽,抗體,鑒定結(jié)果,蛋白


注:DAPI、PE和Merge為3種熒光染料。圖3多肽-1抗體和多肽-2抗體的IFA鑒定結(jié)果(×600)3討論EV-A71的3A蛋白是由病毒基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白之一,由87個(gè)氨基酸組成,其C端有1個(gè)疏水域,其N端為富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域[7]。3A蛋白在脊髓灰質(zhì)炎病毒中具有抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)、參與RNA復(fù)制、維持分子伴侶活性、錨定3D聚合酶等作用,在病毒的復(fù)制中扮演著重要角色。同時(shí),3A蛋白在脊髓灰質(zhì)炎病毒中表現(xiàn)出高度的保守性,我們猜測(cè),在同為腸道病毒的EV-A71中,3A蛋白可能也具有相似的特性與功能[8-10]。已有研究表明,EV-A713A蛋白通過作用于高爾基體的ACBD3蛋白促進(jìn)PI4KB與ACBD3的相互作用從而增強(qiáng)病毒復(fù)制[11-12]。同時(shí),3A蛋白還能與3B蛋白一起參與構(gòu)成具有RNA伴侶活性的3AB蛋白,在EV-A71的復(fù)制中進(jìn)一步起到關(guān)鍵作用[13]。因此3A蛋白的研究對(duì)于EV-A71的感染機(jī)制及抗病毒治療可能具有重大意義。盡管已有關(guān)于作用于3A蛋白的藥物研究,EV-A71全病毒滅活疫苗也進(jìn)入臨床運(yùn)用階段,但對(duì)EV-A71的實(shí)驗(yàn)室研究仍是必不可少的。然而目前在國內(nèi)外的研究中對(duì)3A蛋白功能的解釋尚未完全明確[14-18]。因此,深入研究EV-A71病毒3A蛋白在病毒生命周期中的作用是十分必要的,有利于進(jìn)一步了解EV-A71及。遥


本文編號(hào):3524427

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