目的制備腸道病毒71型（EV-A71）3A蛋白的肽段抗體。方法利用ExPasy和DNAstar軟件對EV-A71 3A蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、親水性及疏水性等生物學(xué)特性進行分析,設(shè)計并合成2條14個氨基酸的多肽。用鑰孔戚血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶聯(lián)肽段作為抗原分別免疫Balb/c小鼠,免疫結(jié)束后取小鼠全血分離血清,用免疫印跡實驗（Western blot）對血清中的3A蛋白抗體進行鑒定。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示,第一條3A蛋白的多肽不能刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體,而第二條多肽能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體。結(jié)論成功制備特異性較好的3A肽段抗體,為進一步研究3A蛋白提供了工具。 

【文章來源】：中國病毒病雜志. 2019,9(04)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

圖１高效液相色譜法測定肽段的純度注：Ａ為高效液相

毒感染細胞裂解液反應(yīng)，結(jié)果如圖２所示，用多肽－１免疫的小鼠血清在３Ａ蛋白對應(yīng)相對分子質(zhì)量１１×１０３處未見條帶（圖２中１～３），提示多肽－１處理的的小鼠血清中沒有３Ａ蛋白的特異性抗體，這可能是多肽－１的免疫原性較差未能刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答所致；而多肽－２免疫的小鼠血清在目標分子量處有明顯條帶（圖２中４～６）提示多肽－２免疫的小鼠血清中存在ＥＶ－Ａ７１３Ａ蛋白的特異性抗體。２．４多肽抗體的ＩＦＡ鑒定用多肽免疫的小鼠血清作為一抗，與ＥＶ－Ａ７１感染的ＲＤ細胞孵育，ＩＦＡ鑒定血清中的抗體，結(jié)果如圖３所示，多肽－１免疫的小鼠血清處理的被感染細胞中未見到紅色熒光，而多肽－２免疫的小鼠血清處理的被感染細胞中有明顯紅色熒光，提示多肽－１免疫的小鼠血清中沒有能與３Ａ有效結(jié)合的抗體，而多肽－２免疫的小鼠血清中存在３Ａ的抗體，這與ＷＢ的結(jié)果一致。注：Ａ為高效液相色譜法測定多肽－１的純度；Ｂ為高效液相色譜法測定多肽－２的純度。圖１高效液相色譜法測定肽段的純度注：１～３為多肽－１處理小鼠的血清平行樣本；４～６為多肽－２處理小鼠的血清平行樣本。圖２ＷＢ法檢測肽段抗體中國病毒病雜志２０１９年７月第９卷第４期ＣｈｉｎＪＶｉｒａｌＤｉｓ，Ｊｕｌｙ２０１９，Ｖｏｌ．９Ｎｏ．４·５６２·

注：ＤＡＰＩ、ＰＥ和Ｍｅｒｇｅ為３種熒光染料。圖３多肽－１抗體和多肽－２抗體的ＩＦＡ鑒定結(jié)果（×６００）３討論ＥＶ－Ａ７１的３Ａ蛋白是由病毒基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白之一，由８７個氨基酸組成，其Ｃ端有１個疏水域，其Ｎ端為富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域［７］。３Ａ蛋白在脊髓灰質(zhì)炎病毒中具有抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運、參與ＲＮＡ復(fù)制、維持分子伴侶活性、錨定３Ｄ聚合酶等作用，在病毒的復(fù)制中扮演著重要角色。同時，３Ａ蛋白在脊髓灰質(zhì)炎病毒中表現(xiàn)出高度的保守性，我們猜測，在同為腸道病毒的ＥＶ－Ａ７１中，３Ａ蛋白可能也具有相似的特性與功能［８－１０］。已有研究表明，ＥＶ－Ａ７１３Ａ蛋白通過作用于高爾基體的ＡＣＢＤ３蛋白促進ＰＩ４ＫＢ與ＡＣＢＤ３的相互作用從而增強病毒復(fù)制［１１－１２］。同時，３Ａ蛋白還能與３Ｂ蛋白一起參與構(gòu)成具有ＲＮＡ伴侶活性的３ＡＢ蛋白，在ＥＶ－Ａ７１的復(fù)制中進一步起到關(guān)鍵作用［１３］。因此３Ａ蛋白的研究對于ＥＶ－Ａ７１的感染機制及抗病毒治療可能具有重大意義。盡管已有關(guān)于作用于３Ａ蛋白的藥物研究，ＥＶ－Ａ７１全病毒滅活疫苗也進入臨床運用階段，但對ＥＶ－Ａ７１的實驗室研究仍是必不可少的。然而目前在國內(nèi)外的研究中對３Ａ蛋白功能的解釋尚未完全明確［１４－１８］。因此，深入研究ＥＶ－Ａ７１病毒３Ａ蛋白在病毒生命周期中的作用是十分必要的，有利于進一步了解ＥＶ－Ａ７１及�。遥�


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