擬獲得乙肝病毒表面抗原preS2/S在Pichia Pastoris酵母中的穩(wěn)定分泌表達(dá)。首先利用畢赤酵母偏愛密碼子對(duì)adr亞型preS2/S基因進(jìn)行修飾。然后分別將preS2/S基因與修飾后的preS2/S基因重組到酵母分泌型表達(dá)載體（pPICZαB）上,形成重組質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)GS115酵母細(xì)胞,分別得到208個(gè)重組子,經(jīng)過(guò)PCR篩選、搖瓶發(fā)酵篩選及酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè),獲得了整合的陽(yáng)性克隆,得到穩(wěn)定表達(dá)的菌株。野生型preS2/S重組子的S抗原ELISA檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性率為80.6%,修飾型preS2/S重組子的S抗原ELISA檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性率為96.8%。將鑒定的陽(yáng)性克隆菌株modpreS2/S 23發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)后,發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳,有特異蛋白條帶,表達(dá)產(chǎn)物單體分子量為32,000Da左右,且在第四天表達(dá)量較高。純化發(fā)酵上清液,可獲得預(yù)期大小的乙肝病毒表面抗原中蛋白（middle protein, MP）,經(jīng)ELISA檢測(cè)S抗原呈強(qiáng)陽(yáng)性,preS2抗原呈弱陽(yáng)性。以上結(jié)果表明,preS2/S基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得了穩(wěn)定分泌表達(dá)。 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

HBV顆粒形態(tài)圖

圖1.2 HBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程.1.4 HBV的分布與傳播途徑世界各地的 HBV 感染率相差很多,提示宿主的遺傳背景不同可能影響 HB感染性。在對(duì)亞洲，非洲和拉丁美洲等乙肝高發(fā)地區(qū)進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)表明，慢性乙肝有明顯的種族傾向性和家族聚集性。宿主的遺傳因素(如MH多態(tài)性)可能也會(huì)影響乙肝的轉(zhuǎn)歸。HBV存在于乙肝病人的血液、汗液、唾液、月經(jīng)、乳汁及淚液等分泌物中乙肝急性期和慢性肝炎急性發(fā)作期時(shí)病人的上述體液及分泌物接觸后，HB入血液中即可傳染上乙肝。HBV 進(jìn)入血液的主要途徑： ①母嬰垂直傳播：國(guó)現(xiàn)有 HBsAg 陽(yáng)性者約 1.4 億人，其中 85％通過(guò)母嬰傳播。垂直傳播是我乙肝蔓延和高發(fā)的主要原因。也有少數(shù)為父嬰傳播者。母嬰傳播主要是通過(guò)

圖1.3 HBV基因組圖BV S區(qū)的基因結(jié)構(gòu)子最外層為S和preS基因編碼的大蛋白、中蛋白和小蛋白形成包膜。里面是核心抗原蛋白形成的核衣殼，包裹著基因組長(zhǎng)約3.2kb，兩條鏈長(zhǎng)度不同，其長(zhǎng)鏈又稱 L(-鏈又稱S(+)鏈，長(zhǎng)度不固定，為長(zhǎng)鏈的50～100％。S區(qū)又preS2基因3段，它們讀碼框相位相同，連續(xù)串連排列并，分別編碼226個(gè)氨基酸的S蛋白、108～119個(gè)氨基酸的酸的preS2蛋白。其中S蛋白稱為主要蛋白或小)，是HBsAg的主要成分，preS2+S蛋白稱為中蛋白(mid+preS2+S 蛋白稱為大蛋白(large protein, LP)[8]（見


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