發(fā)布時(shí)間：2017-05-06 00:08

  本文關(guān)鍵詞：人PD-L1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：PD-L1屬于共刺激分子B7家族成員,含有290個(gè)氨基酸,是I型跨膜蛋白。PD-L1廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及一些非造血細(xì)胞。PD-L1與其受體PD-1結(jié)合后傳遞抑制信號,在T細(xì)胞的活化、耐受和免疫介導(dǎo)的組織損傷中發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用,參與機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持。PD-1/PD-L1途徑與自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)、慢性病毒感染及腫瘤免疫等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。PD-L1分子在多種腫瘤組織中表達(dá),與腫瘤細(xì)胞的分化程度、TNM分期及不良預(yù)后密切相關(guān),可作為多種腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)志物及診斷和治療的靶點(diǎn)。本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/PD-L1,觀察了PD-1/PD-L1途徑對活化Jurkat細(xì)胞增殖與凋亡的影響,證實(shí)PD-L1的負(fù)性免疫調(diào)控作用;以L929/PD-L1為免疫原,采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),建立了穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,并初步研究單抗的生物學(xué)特性。一、人PD-L1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其對活化Jurkat細(xì)胞增殖和凋亡的影響【目的】構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,并鑒定其生物學(xué)活性�！痉椒ā繉⒕幋a人PD-L1分子的全長c DNA重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體p EGZ-Term-R,采用脂質(zhì)體法將重組載體p EGZ-Term-R/PD-L1和輔助的病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝具有感染能力的完整病毒,收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清,感染L929細(xì)胞,篩選并獲得G418抗性的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)篩選并獲得表達(dá)PD-L1的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞,命名為L929/PD-L1。采用PHA活化T細(xì)胞系來源的細(xì)胞株Jurkat,并將其與絲裂霉素預(yù)處理的L929/PD-L1細(xì)胞共培養(yǎng),用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察L929/PD-L1細(xì)胞株對活化Jurkat細(xì)胞增殖能力的影響,并檢測其凋亡情況�！窘Y(jié)果】成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/PD-L1。PHA可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞活化并表達(dá)PD-1分子;L929/PD-L1與PHA刺激后Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng),可抑制Jurkat細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。【結(jié)論】成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,PD-L1分子對活化Jurkat細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的促進(jìn),進(jìn)一步證實(shí)了PD-1/PD-L1途徑的負(fù)性免疫調(diào)控作用,也為進(jìn)一步探討PD-L1的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。二、鼠抗人PD-L1單克隆抗體的研制【目的】研制鼠抗人PD-L1單克隆抗體,為探討PD-1/PD-L1途徑在免疫病理機(jī)制中的作用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。【方法】以L929/PD-L1為免疫原免疫6-8周齡的BALB/c雌鼠,將骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag8與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞融合,采用HAT和HT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤。以L929/PD-L1細(xì)胞株為陽性篩選抗原,采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定、有限稀釋法亞克隆、western blot鑒定等篩選分泌特異性鼠抗人PD-L1單抗的雜交瘤細(xì)胞株;利用小鼠免疫球蛋白亞類快速定性試紙鑒定單抗亞型;以L929/PD-L1細(xì)胞為抗原,采用競爭抑制試驗(yàn)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析單抗的識別位點(diǎn);進(jìn)而比較所獲單抗與商品化單抗MIH1對腫瘤細(xì)胞株表達(dá)的PD-L1分子的識別。【結(jié)果】成功獲得l株能夠持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為6G4;經(jīng)小鼠免疫球蛋白亞類快速定性試紙分析鑒定,6G4的重鏈為Ig M,輕鏈為κ鏈;競爭實(shí)驗(yàn)顯示,單抗6G4與商品化抗人PD-L1單抗MIH1識別的抗原表位不同;另外,單抗6G4與單抗MIH1類似,能夠特異性識別腫瘤細(xì)胞株表達(dá)的PD-L1分子。【結(jié)論】成功建立了穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6G4,該單抗可用于免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)以及western blot檢測PD-L1分子的表達(dá),為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床檢測PD-L1分子的表達(dá)及PD-L1介導(dǎo)的免疫病理機(jī)制研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：PD-L1 基因轉(zhuǎn)染 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 研究背景11-28
• 1 PD-L1 及其受體的結(jié)構(gòu)與表達(dá)譜11-13
• 2 PD-L1 的生物學(xué)作用13-14
• 3 PD-1/PD-L1 途徑與疾病的關(guān)系14-17
• 4 靶向 PD-L1 在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展17-20
• 參考文獻(xiàn)20-28
• 第一部分 人PD-L1 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其對活化JURKAT細(xì)胞增殖和凋亡的影響28-40
• 材料和方法28-32
• 結(jié)果32-35
• 討論35-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 第二部分 鼠抗人PD-L1 單克隆抗體的研制40-55
• 材料與方法40-44
• 結(jié)果44-50
• 討論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 小結(jié)與展望55-56
• 發(fā)表論文和參與科研項(xiàng)目56-57
• 本研究所獲的基金資助57-58
• 中英文對照縮略詞表58-60
• 致謝60-62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Zhixue Zheng;Zhaode Bu;Xijuan Liu;Lianhai Zhang;Ziyu Li;Aiwen Wu;Xiaojiang Wu;Xiaojing Cheng;Xiaofang Xing;Hong Du;Xiaohong Wang;Ying Hu;Jiafu Ji;;Level of circulating PD-L1 expression in patients with advanced gastric cancer and its clinical implications[J];Chinese Journal of Cancer Research;2014年01期

  本文關(guān)鍵詞：人PD-L1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：347357