登革病毒（dengue virus）是人類登革熱（DF）、登革出血熱/登革休克綜合征（DHF/DSS）的病原體。登革病毒感染嚴(yán)重威脅全球近半數(shù)人的健康,然而時(shí)至今日仍然沒有有效的治療藥物和疫苗,因而探索抗登革病毒感染的新策略成為當(dāng)今登革研究的熱點(diǎn)。登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3,其編碼基因在黃病毒中具有高度的保守性,基因全長1854bp,編碼618個(gè)氨基酸,是病毒編碼的第二大蛋白。NS3是一種多功能蛋白,N端具有Ser蛋白酶活性,C端具RNA解旋酶及NTPase、5′RNA三磷酸酶等活性,參與病毒前體的加工和病毒RNA的復(fù)制及基因組RNA的5′端加帽。該蛋白具有很好的免疫原性,并存在特異性CD4⁺和CD8⁺識(shí)別表位,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。鑒于NS3同時(shí)具有病毒復(fù)制所必需的多種酶活性及其良好的免疫原性,其已成為登革抗病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶標(biāo)。本研究工作分為以下三個(gè)部分: 1) DEN NS3表達(dá)體系的構(gòu)建: 提取感染登革2型病毒的C6/36細(xì)胞總RNA,RT-PCR擴(kuò)增目的基因,雙酶切后連入表達(dá)載體,構(gòu)建重組表達(dá)載體... 

【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

NS3全長基因和表達(dá)質(zhì)粒pETZSa一NS3的酶切鑒定電泳圖

在含氨節(jié)青霉素的平板上選擇陽性克隆，PCR及Hindlll、Nhel酶切分析鑒定陽性克隆，均獲得相應(yīng)的目的基因片段。重組原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET32a一dNS3。圖2為峪3蛋白NTPase/RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域(160一618aa)基因和表達(dá)質(zhì)粒pET32a一dNS3的酶切鑒定電泳圖。圖2克隆基因和表達(dá)質(zhì)粒pET32a一dNS3的酶切鑒定電泳圖M:DNA標(biāo)記物(marker):1.Hindlll單切pET28a對(duì)照質(zhì)粒;2.Hindlll單切質(zhì)粒pET32a一dNS3;3.Hindlll、BamHl雙切質(zhì)粒pET32a一dNS3;4.PCR產(chǎn)物

在含卡那霉素的平板上選擇陽性克隆，PCR及Hindlll、Noc工酶切分析鑒定陽性克隆，獲得相應(yīng)大小的目的基因片段。重組原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET28a一dNs3。圖3為NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域(160一618aa)基因和表達(dá)質(zhì)粒pET28-aNdS3的酶切鑒定電泳圖。將篩選到的陽性克隆送上海生工測序，測序表明所克隆蛋白NTPase/RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域基因與Genebank中登革2型病毒DZ一43株序列一致，未出現(xiàn)錯(cuò)意突變，酶切結(jié)果顯示插入正確。圖3克隆基因和表達(dá)質(zhì)粒pET28a一dNS3的酶切鑒定電泳圖M:DNA標(biāo)記物(marker):1.Hindlll單切質(zhì)粒pET28a一dNS3;2.Hindlll、Neol雙切質(zhì)粒pET28a一dNS3;3.Hindlll單切pET28a對(duì)照質(zhì)粒:4.PCR產(chǎn)物.32重組蛋白的表達(dá).32.1NS3全長蛋白的表達(dá)攜帶有重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a一NS3的工程菌經(jīng)PITG誘導(dǎo)后表達(dá)一個(gè)分子量約為68kDa的特異蛋白，大小與預(yù)期一致，且對(duì)照菌無此蛋白出現(xiàn)。目的蛋白在宿主菌BL21(DE3)中以包涵體的形式表達(dá)，破碎菌體離心后的上清中無此蛋白出現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化后，NS3全長蛋白其表達(dá)產(chǎn)物的可溶性未獲得改蓋


本文編號(hào)：3466380