目的:摸索人源瞬時(shí)受體電位M2型通道（TRPM2）羧基端Nudix水解酶9（NUDT9）同源結(jié)構(gòu)域（NUDT9-H）的蛋白提取和純化方法。方法:異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)的Rosetta（DE3）大腸埃希菌菌株經(jīng)超聲破碎和離心后,將收集到的上清液與GST磁珠結(jié)合并用還原型谷胱甘肽洗脫以抽提GST-NUDT9-H融合蛋白,濃縮離心后再經(jīng)分子排阻色譜層析純化,最后經(jīng)凝血酶酶切并與GST磁珠結(jié)合即得NUDT9-H蛋白。結(jié)果:含有0.5%的十二烷基-β-D-麥芽糖苷（DDM）裂解溶液體系和0.025%的DDM分子排阻層析色譜溶液體系能夠提高GST-NUDT9-H融合蛋白的穩(wěn)定性,再按每2 mg融合蛋白加入1 U凝血酶切割24 h,即獲得高純度NUDT9-H蛋白。結(jié)論:NUDT9-H蛋白穩(wěn)定性較差,提取和純化體系中需添加DDM以穩(wěn)定其構(gòu)象從而提高目的蛋白的產(chǎn)量和純度。 

【文章來(lái)源】：浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019,48(01)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

細(xì)菌裂解上清液與GST磁珠重結(jié)合可以提高產(chǎn)量FT：流過(guò)濾器的上清裂解液；W1：第一次洗滌液；W2：第二次洗滌液；E1：第一次洗脫液；E2：第二次洗脫液.

葉培武，等.人源瞬時(shí)受體電位M2型通道Nudix水解酶9同源結(jié)構(gòu)域的提取和純化層析系統(tǒng)中不含有DDM等能夠穩(wěn)定蛋白的表面活性劑時(shí)，融合蛋白在層析過(guò)程中仍會(huì)發(fā)生片段化，因此，層析系統(tǒng)的緩沖液體系需要添加DDM。本實(shí)驗(yàn)在含50mmol/LTris、150mmol/L氯化鈉且酸堿度為7.4的緩沖液中添加DDM至其終濃度為0.025%。將粗提步驟中洗脫得到的蛋白洗脫液進(jìn)行濃縮，而后上樣過(guò)分子篩，收集蛋白峰所對(duì)應(yīng)編號(hào)收集管并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)。圖4可見(jiàn)，蛋白純化過(guò)程中0.025%的DDM就足以促進(jìn)融合蛋白的穩(wěn)定，減少25kD左右片段化蛋白的生成。2.5酶切條件摸索結(jié)果本實(shí)驗(yàn)中純化蛋白指NUDT9-H與GST標(biāo)簽蛋白的融合蛋白，兩者通過(guò)凝血酶識(shí)別的氨基酸序列連接，然而最終進(jìn)行功能檢測(cè)及結(jié)構(gòu)解析所需的蛋白是獨(dú)立的NUDT9-H。NUDT9-H與GST大小接近，無(wú)法排除GST在功能檢測(cè)和結(jié)構(gòu)解析時(shí)對(duì)目的蛋白的影響，因此需要用凝血酶切除GST，反向與GST磁珠結(jié)合以去除未切割完全的融合蛋白及切下的GST標(biāo)簽蛋白，NUDT9-H片段則在上清液體系中收集，并在280nm波長(zhǎng)下初步測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)圖4結(jié)果，取17、18兩管樣品，按照1U/2mg或0.5U/2mg蛋白的量加入凝血酶。綜合圖5A兩份樣品酶切蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，根據(jù)回收得到30.7kD大小目的蛋白的產(chǎn)率判斷，最佳的酶切條件是1U/2mg蛋白的酶量下酶切24h。將剩余融合蛋白峰對(duì)應(yīng)編號(hào)的蛋白樣本液濃縮后按照前述方法酶切，再與GST磁珠掛住結(jié)合后收集上清液，并對(duì)各步驟樣品制蛋白樣進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)，可得到高純度的30.7kD目的蛋白NUDT9-H（圖5B

細(xì)菌裂解上清液與GST磁珠重結(jié)合可以提高產(chǎn)量Figure3Re-bindingofthelysatewithregenerativeGSTbeadsleadstohigherproductionoffusionprotein14～20：過(guò)分子篩后的蛋白在出峰時(shí)由對(duì)應(yīng)編號(hào)收集管收集到的蛋白樣本.DDM：十二烷基-β-D-麥芽糖苷.圖4在純化緩沖液體系中添加0.025%DDM有助于獲得穩(wěn)定的目的蛋白Figure40.025%DDMinwashbufferstabilizedthefusionproteininpurificationsystemM：標(biāo)準(zhǔn)帶；17、18：過(guò)分子篩后的蛋白在出峰時(shí)電對(duì)應(yīng)編號(hào)吸集管收集到的蛋白樣.圖5融合蛋白酶切時(shí)間和濃度優(yōu)化Figure5Optimizationonthecleavagetimeandconcentrationofthrombin··9


本文編號(hào)：3454678