本文關(guān)鍵詞：RACK1在肝細(xì)胞自噬中的作用和潛在的分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞生長(zhǎng)、衰老、死亡等多種生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用,這些信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的形成是由具有一定特異性的相對(duì)少量的信號(hào)分子(即支架蛋白)來(lái)完成的。激活的蛋白激酶C受體1(RACK1,基因名Gnb2l1)就是這樣的一種支架蛋白。RACK1分子量為36 kDa,含有7個(gè)WD40重復(fù)序列,與G蛋白β亞基具有高同源性,在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中可以作為錨定蛋白和穿梭蛋白以參與信號(hào)的傳導(dǎo)或活化。大量研究表明RACK1在肝細(xì)胞癌等腫瘤的惡性生長(zhǎng)中有著重要促進(jìn)作用。而且RACK1在肝組織中高水平表達(dá),但其在肝臟中的病理生理作用還是未知的。自噬是一個(gè)高度保守的細(xì)胞固有的生命進(jìn)程,這個(gè)過(guò)程中,細(xì)胞的一些多余的成分或衰老的器官被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解或者分解。以此作為機(jī)體重要的降解去路而存在。在肝臟中,自噬促進(jìn)脂肪降解,有利于脂代謝穩(wěn)態(tài)的維持。自噬的啟動(dòng)自噬的啟動(dòng)需要AMPK活化或mTOR活性受抑導(dǎo)致的ULK1活化,接著ULK1磷酸化Beclin1導(dǎo)致自噬起始復(fù)合體ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15形成,MAPK家族成員JNK對(duì)Bcl2的磷酸化促使Bcl2與Beclin1解離,也有利于自噬起始復(fù)合體形成。Class III PI3K VPS34(也稱(chēng)為PIK3C3)激酶活性在復(fù)合物形成后升高,催化磷脂酰肌醇(PI3P)生成,招募DFCP1形成Omega小體,進(jìn)而ATG12-ATG5共價(jià)結(jié)合,促進(jìn)膜延伸和閉合,誘導(dǎo)LC3B從胞漿型(LC3B I)轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?LC3B II)、促進(jìn)自噬體的形成。但是自噬起始復(fù)合體的形成機(jī)制還不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn),RACK1對(duì)自噬有促進(jìn)性作用,并且參與自噬起始復(fù)合體的形成,RACK1缺失導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪堆積。這將為自噬的相關(guān)機(jī)制的研究和脂肪肝的治療方面的探索提供一些依據(jù)。目的:在肝來(lái)源細(xì)胞中探索RACK1對(duì)自噬是否有影響;探討RACK1預(yù)防肝細(xì)胞脂肪堆積的作用;分析RACK1影響自噬的分子機(jī)制。方法:以饑餓或mTOR抑制因子處理誘導(dǎo)自噬,以氯喹阻斷溶酶體活性;在上述處ii理前后通過(guò)westernblot檢測(cè)自噬相關(guān)指標(biāo)lc3bii和atg12-atg5等的表達(dá);透射電鏡觀察饑餓誘導(dǎo)自噬小體和脂肪滴的形成;nilered染色分析脂肪堆積;免疫熒光分析dfcp1opuncta的形成;激酶活性分析的方法檢測(cè)vps34活性;免疫沉淀與銀染、質(zhì)譜鑒定相結(jié)合尋找rack1相互作用蛋白;利用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證rack1和自噬起始復(fù)合體atg14l-beclin1-vps34-vps15之間的相互作用;利用gst-pulldown的方法檢測(cè)體外翻譯的自噬起始復(fù)合體成分和rack1的直接結(jié)合。結(jié)果:1)rack1促進(jìn)自噬并抑制肝細(xì)胞中脂肪堆積在肝來(lái)源細(xì)胞系中敲低內(nèi)源rack1的表達(dá),自噬標(biāo)志物lc3bii的本底水平和饑餓誘導(dǎo)的lc3bii生成顯著降低。rack1敲低的情況下,mtor抑制因子和/或氯喹作用后的lc3bii水平也降低,說(shuō)明lc3bii水平下降的原因是自噬減少而不是溶酶體活性過(guò)強(qiáng)。westernblot鑒定gnb2l1f/f;alb-cre(即gnb2l1?hep)小鼠表明,rack1在肝細(xì)胞中的表達(dá)缺失,但在其它組織中的表達(dá)與對(duì)照gnb2l1f/f小鼠無(wú)差異。gnb2l1?hep小鼠從生后4個(gè)月起肝臟變大、變黃;透射電鏡下可見(jiàn)6周大gnb2l1?hep小鼠的肝細(xì)胞脂肪滴增多而糖原減少、線(xiàn)粒體數(shù)量增多但體積變小;饑餓48小時(shí)后,gnb2l1f/f小鼠肝細(xì)胞中出現(xiàn)較多自噬小體,而gnb2l1?hep小鼠的肝細(xì)胞無(wú)自噬小體,并且線(xiàn)粒體膨脹、脂肪滴數(shù)量和體積增大。nilered染色證實(shí)了脂肪的堆積。westernblot表明饑餓前后gnb2l1?hep小鼠肝組織lc3bii生成均減少,證實(shí)rack1的缺失導(dǎo)致自噬水平的降低。2)rack1參與自噬的早期進(jìn)程lc3bii的生成依賴(lài)于atg12-atg5的共價(jià)結(jié)合,westernblot表明饑餓前后gnb2l1?hep小鼠肝組織atg12-atg5生成均減少,提示rack1影響更早期的分子事件。在rack1敲低的肝來(lái)源細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)gfp-dfcp1,發(fā)現(xiàn)rack1敲低導(dǎo)致dfcp1opuncta形成的減少;并且整體vps34激酶活性或atg14l相關(guān)的vps34激酶活性均在rack1敲低或敲除的情況下降低,表明rack1參與自噬的早期進(jìn)程。3)rack1促進(jìn)自噬起始復(fù)合體的形成為了進(jìn)一步揭示rack1參與自噬的分子機(jī)制,我們?cè)趓ack1敲低的人肝來(lái)源細(xì)胞中表達(dá)GFP標(biāo)簽的人源RACK1分子,由于GFP-RACK1也受RNA干擾作用的影響,表達(dá)量很低,可以作為內(nèi)源RACK1分子發(fā)揮作用。免疫沉淀饑餓前后肝來(lái)源細(xì)胞中的“內(nèi)源樣”GFP-RACK1分子,經(jīng)銀染和質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能的RACK1結(jié)合蛋白VPS15,提示RACK1是自噬起始復(fù)合體的一個(gè)成分。免疫共沉淀證實(shí)了這一推測(cè)Gnb2l1?hep小鼠肝組織中,自噬起始復(fù)合體的形成顯著減少,說(shuō)明RACK1促進(jìn)自噬起始復(fù)合體的形成。4)RACK1形成二聚體并直接結(jié)合ATG14L,Beclin1,和VPS15在肝來(lái)源的細(xì)胞中表達(dá)外源的Flag-RACK1和GFP-RACK1,anti-FLAG免疫沉淀物中可以同時(shí)檢測(cè)到兩種不同標(biāo)簽的RACK1的存在,并且在饑餓處理后1h時(shí),FLAG-RACK1共結(jié)合的GFP-RACK1量升高最為明顯。GST-RACK1分別和體外翻譯的VPS15、VPS34、ATG14L、Beclin1進(jìn)行GST-pull down分析,復(fù)合物中可以檢測(cè)到VPS15、ATG14L、Beclin1的存在,表明RACK1直接與ATG14L,Beclin1和VPS15結(jié)合。5)RACK1不影響AMPK,Ulk1,JNK活化Western Blot表明饑餓前后Gnb2l1?hep小鼠肝組織P-JNK,P-AMPK,P-Ulk1無(wú)缺陷。結(jié)論:肝細(xì)胞中,RACK1能夠穩(wěn)定自噬早期復(fù)合物的形成和促進(jìn)自噬啟動(dòng),維持正常的自噬功能,從而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和抑制脂肪堆積。
【關(guān)鍵詞】：RACK1 自噬 LC3B 自噬起始復(fù)合物 ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-16
• 第一章 在肝來(lái)源細(xì)胞中檢測(cè)RACK1對(duì)自噬的影響16-24
• 第一節(jié) 在肝來(lái)源細(xì)胞系中探討RACK1對(duì)自噬的影響16-21
• 1 材料和方法16-19
• 2 結(jié)果19-20
• 3 討論20-21
• 第二節(jié) 肝來(lái)源細(xì)胞中RACK1對(duì)自噬流的影響21-23
• 1 材料與方法21
• 2 結(jié)果21-22
• 3 討論22-23
• 本章小結(jié)23-24
• 第二章 在條件性敲除RACK1的小鼠肝臟組織中探討RACK1對(duì)自噬影響24-34
• 第一節(jié) 條件性敲除RACK1的檢測(cè)24-27
• 1 材料和方法24
• 2 結(jié)果24-26
• 3 討論26-27
• 第二節(jié) 在小鼠肝組織中敲除RACK1對(duì)肝組織的影響27-32
• 1.材料與方法27-29
• 2 結(jié)果29-31
• 3 討論31-32
• 本章小結(jié)32-34
• 第三章 RACK1對(duì)自噬影響的機(jī)制探討34-59
• 第一節(jié) RACK1是對(duì)自噬體復(fù)合物的影響的探討34-38
• 1 材料和方法34
• 2 結(jié)果34-37
• 3 討論37-38
• 第二節(jié) RACK1對(duì)自噬起始復(fù)合體PI3KC3的活性分析38-41
• 1 材料和方法38-39
• 2 結(jié)果39-40
• 3 討論40-41
• 第三節(jié) RACK1自噬相關(guān)共結(jié)合復(fù)合物的檢測(cè)41-44
• 1.材料和方法41-42
• 2 結(jié)果42-43
• 3 討論43-44
• 第四節(jié) RACK1與自噬起始復(fù)合體各成分相互作用的探索44-48
• 1 材料和方法44
• 2 結(jié)果44-47
• 3 討論47-48
• 第五節(jié) RACK1和自噬起始復(fù)合體各成分之間相互作用形式的探索48-52
• 1 材料和方法48-50
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-51
• 3 討論51-52
• 第六節(jié) RACK1在自噬起始復(fù)合體中存在形式52-55
• 1 實(shí)驗(yàn)材料和方法52
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論52-54
• 4 結(jié)論54-55
• 第七節(jié) RACK1在自噬復(fù)合體中的作用的探索55-57
• 1 材料和方法55
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-56
• 3 結(jié)論56-57
• 第八節(jié) RACK1對(duì)自噬影響的其它通路的探索57-58
• 1 材料和方法57
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-58
• 3 結(jié)論58
• 本章小結(jié)58-59
• 全文總結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 綜述 P62在自噬、凋亡和腫瘤中作用64-73
• 參考文獻(xiàn)71-73
• 碩士期間發(fā)表論文73-74
• 致謝74-76

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 趙亞偉;RACK1在肝細(xì)胞自噬中的作用和潛在的分子機(jī)制[D];河南大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：RACK1在肝細(xì)胞自噬中的作用和潛在的分子機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：344979