目的通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX）篩選特異性結(jié)合幽門螺桿菌（H.pylori）黏附蛋白A（HpaA）的核酸適配子,并鑒定其結(jié)合特性。方法構(gòu)建pET28a/HpaA原核表達質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達純化重組HpaA蛋白;以重組HpaA蛋白為靶標(biāo)利用SELEX技術(shù)篩選出能夠與HpaA具有高特異性、高親和力結(jié)合的核酸適配子。隨后利用篩選所得HpaA適配子通過體外實驗驗證與H.pylori菌體的結(jié)合以及對臨床胃黏膜切片中H.pylori的檢測效能。結(jié)果本研究培養(yǎng)并提取ATCC26695菌株基因組,通過PCR擴增HpaA部分基因長度約699 bp,并成功克隆構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET28a/HpaA。經(jīng)異丙基β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達、純化獲得純度約98%的重組HpaA蛋白作為篩選靶標(biāo)。利用SELEX技術(shù)通過10輪正向篩選和5輪的負(fù)向篩選,獲得6條與HpaA高親和力的適配子分別命名為HA1～HA6。其中適配子HA6具有較高的親和力和特異性,且適配子HA6核心序列在體外仍表現(xiàn)出與H.pylori菌體較高的結(jié)合力;利用羥基熒光素（FAM）標(biāo)記的HA6適配子對166例H.pylori感染的患... 

【文章來源】：細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2019,35(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

HPLC鑒定純化的重組蛋白HpaA

純化的重組蛋白HpaA序號肽段序列(N端→C端)相似度1QALDEKILLLＲPAFQYS100%2KEGYLAVAMNGEIVLＲPDPKＲ100%3PDPKＲTIQKKSEPGLLFSTG100%4FVKVTILEPMSG100%5DNSNDAIKS100%2．3適配子的篩選及特性驗證合成長度為88個核苷酸的文庫，經(jīng)由10輪的正向篩選和5輪的負(fù)向篩選后，分別對收獲的10輪文庫的相對結(jié)合力進行檢測。結(jié)果顯示第1輪到第5輪的相對結(jié)合力呈上升趨勢，第5輪后負(fù)向篩選的加入使得相對結(jié)合力暫時下降，但隨著篩選輪數(shù)的增加其結(jié)合力仍呈增高趨勢，且高于前5輪(圖5)。再將第10輪適配子擴增為雙鏈并克隆進pUC19質(zhì)粒中，挑選的43個克隆經(jīng)酶切鑒定其中有40個陽性克隆(圖6);將其中結(jié)合力相對較高的6個克隆擴增所得適配子編號為HA1～HA6，并使用這6種適配子對5種不同的細(xì)菌(大腸桿菌、陰溝桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌、H．pylori)進行特異性鑒定，其中HA6對H．pylori表現(xiàn)出較高的特異性(圖7);隨后，對這HA6適配子的全長序列和核心序列的ssDNA親和力進行檢測，其KD值分別為:(8．531±1．59)nmol/L和(6．520±1．489)nmol/L(圖8)。bP＜0．01vs第10輪．圖5不同輪數(shù)文庫的相對結(jié)合力的比較圖6限制性內(nèi)切酶酶切鑒定分析適配子單克隆圖7不同單克隆適配子對5種菌株檢測性能的比較2．4適配子對Hp感染的診斷效能使用FAM標(biāo)記的HA6作為檢測配基對胃黏膜H．pylori進行檢測，在共聚焦顯微鏡下觀察熒光，綠色熒光記為FAM-HA6結(jié)合H．pylori菌體，羅丹明標(biāo)記的H．pylori菌體為紅色，合并后呈黃色。本檢測的陽性率為94．5

Τ噬仙?魘疲??5輪后負(fù)向篩選的加入使得相對結(jié)合力暫時下降，但隨著篩選輪數(shù)的增加其結(jié)合力仍呈增高趨勢，且高于前5輪(圖5)。再將第10輪適配子擴增為雙鏈并克隆進pUC19質(zhì)粒中，挑選的43個克隆經(jīng)酶切鑒定其中有40個陽性克隆(圖6);將其中結(jié)合力相對較高的6個克隆擴增所得適配子編號為HA1～HA6，并使用這6種適配子對5種不同的細(xì)菌(大腸桿菌、陰溝桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌、H．pylori)進行特異性鑒定，其中HA6對H．pylori表現(xiàn)出較高的特異性(圖7);隨后，對這HA6適配子的全長序列和核心序列的ssDNA親和力進行檢測，其KD值分別為:(8．531±1．59)nmol/L和(6．520±1．489)nmol/L(圖8)。bP＜0．01vs第10輪．圖5不同輪數(shù)文庫的相對結(jié)合力的比較圖6限制性內(nèi)切酶酶切鑒定分析適配子單克隆圖7不同單克隆適配子對5種菌株檢測性能的比較2．4適配子對Hp感染的診斷效能使用FAM標(biāo)記的HA6作為檢測配基對胃黏膜H．pylori進行檢測，在共聚焦顯微鏡下觀察熒光，綠色熒光記為FAM-HA6結(jié)合H．pylori菌體，羅丹明標(biāo)記的H．pylori菌體為紅色，合并后呈黃色。本檢測的陽性率為94．58%(157/166)，ＲUT陽性率為87．95%(146/166)。與患者的ＲUT結(jié)果比對，發(fā)現(xiàn)二者檢測結(jié)果符合率較高，且適配子熒光法高于ＲUT，兩種方法差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．0325，圖9)。635細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(ChinJCellMolImmunol)2019，35(6)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]血清幽門螺桿菌HpaA抗體與胃癌風(fēng)險關(guān)系的研究[J]. 張冰,李環(huán).  吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報. 2018(06)
[2]抗幽門螺桿菌多價蛋黃液IgY抗體的制備[J]. 孫禮進,張忠寶,曾波,陳詠梅,李浩,周紅妹,張智,李再新.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2018(06)



本文編號：3422140