人呼吸道合胞病毒G蛋白多肽重組腺病毒的構(gòu)建、表達與鑒定 目的 人工合成的人呼吸道合胞病毒（hRSV）G蛋白多肽,含有兩個二硫鍵和多個保護性B細胞表位,免疫動物后,能產(chǎn)生高水平的保護性抗體,可作為一種新型RSV疫苗抗原。本文采用非復(fù)制型膿病毒載體,利用同源重組方法,獲得表達G蛋白多肽的非復(fù)制型重組腺病毒。 方法 本文根據(jù)G蛋白多肽堿基序列的需要,設(shè)計并合成了帶有突變核苷酸序列的寡聚核苷酸引物,以G基因RT-PCR產(chǎn)物為模板,采用高保真DNA聚合酶,PCR突變擴增,得到G蛋白多肽編碼序列。利用普通Taq DNA聚合酶PCR產(chǎn)物3′末端加“A”特性,將G蛋白多肽編碼序列3′平末端加“A”,并與T載體連接。并將外源性基因亞克隆于穿梭載體pShuttle—CMV。PmeⅠ線性化重組穿梭載體,與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在E.coli BJ5183細胞內(nèi)同源重組得到重組腺病毒DNA質(zhì)粒。以Pac Ⅰ酶切獲得的重組腺病毒DNA分子,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細胞,產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒。PCR方法檢測G蛋白多肽在重組腺病毒中的穩(wěn)定整合。 結(jié)果 利用帶有突變核苷酸序列的寡核苷酸... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

一I正常H月p一2細胞Figs一1Nomra1HEP一2eell圖5一2Fjgs一2.22R不PCR獲得RSVC蛋白編碼基因病變的H即一2細胞CPEofHEP一2eell

RI飛PCR擴增G蛋白編碼基因Fig6GgenewasmaPlifiedbyRT，PCRDL200ODNAMakrer(2000，1000，750，500，250，‘100bP)

7PCR突變法擴增mGPmGPgenewasamPlifiedbyPCRker(2000，1000，750，500，25mGppCR產(chǎn)物(207bp)erase高保真酶擴增獲得的m。連接產(chǎn)物經(jīng)Notl單酶雙鑒定，同時送公司測序。(圖


本文編號：3414195