BiTEs（bispecific T cell engagers）是以T細胞作為效應細胞的雙特異性單鏈抗體,它采用單鏈抗體技術(shù),將兩個不同抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)連接在一條多肽鏈上,并作為活性蛋白在CHO細胞中進行分泌表達,其基本的形式是V_L1-linker-V_H1-linker-V_H2-linker-V_L2。BiTEs具有兩個抗原結(jié)合部位,可以同時和T細胞及病變細胞表面的抗原分子結(jié)合,從而有效地激活靜止的T細胞來達到殺傷病變細胞的目的�？笴D3/抗CD20雙特異性單鏈抗體是一種BiTEs形式的極具潛力的新型工程抗體,它以CD20為靶標,具有靶向殺傷B細胞淋巴瘤的功能。 本實驗通過重疊延伸PCR擴增獲得抗CD3/抗CD20雙特異性單鏈抗體完整基因片段:前導序列—VL_CD3—（G₄S）₃—VH_CD3—（G₄S）₃—VH_CD20—（G_4<... 

【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學院北京市

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

通過Nhel、Notl酶切鑒定轉(zhuǎn)化子中的陽性質(zhì)粒

30001200圖1一7通過Nhel、Notl酶切鑒定轉(zhuǎn)化子中的陽性質(zhì)粒測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4#質(zhì)粒700一1619bp經(jīng)測序全部正確，用Bgl11和Notl雙酶切下700一1619bp作為片段a，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收。5#質(zhì)粒1一70Obp經(jīng)測序在413bp處發(fā)生堿基缺失突變，用Nhel和Bglll雙酶切1一700bp的片段，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收。采用重疊延伸CPR的方法修改該片段的突變，得到片段b。將片段a、b連入pDcNA3.l載體，序列分析知目的基因正確連接到載體上

實驗結(jié)果分別收集轉(zhuǎn)染2h4、3h6后的COS一7表達上清，采用直接競爭法ELIAs檢測后顯色(圖2)及0D450nm測量結(jié)果(表2)，并與空白對照和陰性對照相比較，可以證明抗DC3/抗DC20雙特異性單鏈抗體在COS一7細胞中進行了瞬時表達，且在轉(zhuǎn)染36h時表達較高，這說明了我們構(gòu)建的抗Dc3/抗CD20雙特異性單鏈抗體可以在哺乳動物細胞中進行分泌表達，其前導序列、KOZAK序列均符合哺乳動物細胞表達要求，為下一步抗Dc3/抗Dc20雙特異性單鏈抗體的穩(wěn)定表達及穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。圖2直接競爭ELISA檢測目的基因瞬時表達的顯色圖Al:陰性對照;A2:空白對照;Bl:樣品(轉(zhuǎn)染3h6收獲的上清);B2:樣品(轉(zhuǎn)染2h4收獲的上清):Gl:陽性對照表2酶標儀450mn測量的OD值l2A0.000es0


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